ＧＢ／Ｔ１５８０５《鱼类检疫方法》分为7个部分，本部分为ＧＢ／Ｔ１５８０５的第５部分。本部分为ＧＢ／Ｔ１５８０５的第５部分。ＧＢ／Ｔ１５８０５的本部分规定了细胞分离病毒后，用ＲＴ?ＰＣＲ 技术检测ＳＶＣＶ 的方法。本部分适用于ＳＶＣＶ 的分离和鉴定，ＳＶＣ 的流行病学调查、诊断，以及口岸出入境、国内跨区域移动的检疫。本部分与ＧＢ／Ｔ１５８０５．１—１９９５的第７章相比主要变化如下： ———删除了临床检查； ———改用ＰＣＲ 方法代替中和试验鉴定ＳＶＣＶ； ———增加资料性附录Ｂ“ＳＶＣ 病毒Ｇ 基因的全序列（１５８８ｂｐ）”； ———结构格式按ＧＢ／Ｔ１．１—２０００的规定，作为部分编写。

ICS 65. 020. 30
中华人民共和国国家标准
GB/T15805.5—2008
部分代替GB/T15805.1·-1995
鱼类检疫方法
第5部分：鲤春病毒血症病毒（SVCV）Quarantine methods of fish-
Part 5:Spring viraemia of carp virus(SvCv)2008-07-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-11-01实施
GB/T15805鱼类检疫方法\分为下列部分：第 1部分:传染性胰脏坏死病毒(IPNV);-第2部分:传染性造血器宫坏死病萨(IHNV);第3部分：病毒性出血性败血症病毒(VHSV)：第4部分：斑点叉尾酮病(CCV)；-第5部分:鲤春病毒血症病毒(SVCV);第6部分：杀气单胞菌；
第7部分：脑粘体虫：
本部分为GB/T15805的第5部分。GB/T 15805.5—2008
本部分代替GB/T15805.1一1995&淡水值类检疫方法第一部分3中的第7章。本部分与 GI3/T 15805.1—1995 的第7章相比主要变化如下：…·删除了临床检查，
改用PCR方法代替中和试验鉴定SVCV：-增加资料性附录B\SVC病毒G基因的全序列(1588 bp)\结构格按GB/T1.1—2000的规定，作为部分编写，本部分的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。本部分越草单位：农业部全国水产技术推广总站、中华人民共和国深圳出人境检验检胶局。本部分主要起草人：孙喜模、江育林、陈爱平、陈辉、朱泽闻。本部分所代替标雅的历软版本发布情况为：GB/T15805.1—1995。
1范围
鱼类检疫方法
第5部分：鲤春病毒血症病毒（SVCV)GB/T 15805.5—2008
GB/T15805的本部分规定了细胞分离病市后，用RT-PCR技术检测SVCV的方法。本部分适用于SVCV的分离和鉴定，SVC的流行病学调查，诊断，以及口岸出入境、国内跨区域移动的检疫。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T15805的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T66821992分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696：1987）GB/T18088—2000出入境动物检疫采样3试剂和材料
3.1水GB/T6682一1992，一级。用于RT-PCR（包括核酸抽提）时所用的水要用焦碳酸二Z脂(DEFC>处理以除掉RNA酶。
3.2SVCV参考株：由农业部指定的动物病原微生物菌(毒）种保藏机构提供。3.3Tag酶：—20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.4转录酶AMV10U/mL，—20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.5RNA抑制剂(RNasin>：40U/uL：—20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。3.6dNTP（含dCTP、dGTP、ATP、dTTP各10mmol/L)。3.7引物：该试验选用SVCV的糖蛋向基因作为PCR的模板。该基因长1588bp，在这里用了两对引物：F1和R2扩增该基因中的714bp片断，而F1和R4则从该片断中再扩增606bp片断。所以实际上是“半套式\的PCR（semi-estedPCR)，使用时浓度为40umol/L。其序列如下：R2:'-AGATGGTATGGACCCCAATACATHACNCAY-3'.R4:5'-CTG GGG TTT CCN CCT CAA AGY TGY-3'。FI:5'-TCT TGG AGC CAA ATA GCT CAR RTC-3'。3.8无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。3.9矿物油，要求无DNA酶和RNA酶。3.10DNA分子质量标准(Markcr)。4器材和设备
4.196孔细胞培养板。
4.2倒置显微镜。
4.3恒温培养箱。
4.4普通冰箱和低温冰箱。
GB/T 15805.5—2008
4.5组织研磨器。
4.6离心机和离心管。
4.7PCR扩增仪
4.8 电泳仪。
4.9微量移液器及吸头。
4.10紫外观察灯。
5SVCV的分离
5.1采样
按GB/T180882000的规定执行。对有临床症快的鱼，如是体长4cm的鱼苗取整条鱼：体长
4cm~6cm的鱼苗取内脏(包糖紧）；体长关于6cm的鱼则取脑肝、肾、脾面对无症状的鱼要取肾、
肿、和脑组织；成熟维鱼逆繁单巢液。5.2样品处理
光实数研磨器
应在10 芒以下。
液（见第A，10章）中
姐在勾
1000IU/mL青霉素
6 h~24 h。7000量
离心15 m
不必勾浆但需稀释脑倍激上，用相5.3病毒分离
对1：10的纳
的清滋以适当健
聚上清液再
刷接种到生
释液。15
单层最彩接种10吨
培养。试验中要駕2乳阳性对照（阳性对照和待侧样
静都接种细
浆上清稀释的细
外，没有 CPE出现，翼
稀释液的细胞单层培霜
中是香出
鑫养7d后
亲融一次
多心卵液样品
4 h 的 CO.EPC 或者
内每天用40卡
10的最终稀餐度重悬于细胞培养将精品勾暴后再悬浮于含有
下孵育 h～h或 4℃下孵育
述度的抗菌繁处理以防污染。
的步骤中意按用其上清我。
1：100和1100三个释度
细胞单层中每孔(2 cm)的细胞
细脑培葬液。臀 15 ℃～2℃
腰种病毒的胞塞
倒置显微意检聋，接种了被检勾应当正常如除阳性对照细胞
传代时，将接种了组织勾浆上清收集上滑液。上消液接种到新
群品缝过接种细胞和育传后均没鲜细胞单层，培养了d。
镜检查。
勇如看CPE山现，则要用RT-PCR方法进贫鉴定是否由SVCV引起。有CPE出现，则结果判身度
如果阳性对照也未出螺旺试验无效。应采用敏感细胞和进行病毒学检查。
6SVCV的鉴定
6.1样品处理
新的组织样品重新按上述方法
将450μL细胞病变悬液放人1.5mL的离心管，再加入450μLCTAB溶液（见第A.1章）并混匀。25℃作用2h。
6.2RNA 抽提
在含有样品的塑料离心管中加人600ul抽提液2（见第A3章）、用力混合至少305。120001/min离心5min，小心取上层水相（约800mL）。再加人700μL抽提液1（见第A.2意），用力混合至少30s12000r/min离心5min，小心取1层水相（约600μL）。再加人一20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇（约900μL），倒置数次混勾后，-20℃8h以上沉淀核酸。12000r/nin高心30min，小心弃去上清液。干煤后加10 L水溶解，作为PCR模板。6.3变性和退火
在PCR管中加人10叫模板和2.5引物R2，2.5水使总体积为15L。置于70℃反应2
TTKAONTKAca
5nin。立即冰浴，低速离心约5s，使液体集中在底部。6.4cDNA 合成
GB/T15805.5—2008
在上述反应管中继续加人：5L的5倍逆转录酶浓缩缓冲液（见第A.5章）.2μL.dNTP.0.5μLRNA酶抑制剂(20U)、IμL逆转录酶AMV(10U)和1.5L水。总体积为25μL,42℃60min反应以合成模板的cDNA。
6.5PCR扩增DNA
在上述反应管中再继续加入：10倍Taq酶用浓缩缓冲液（见第A.7章）8μL、25mIno1/L的氧化镁(MgCla）见第A.6章)μL.dNTP2物R和引物F12μL,Ta酶5U、加水到总体积为100μL。每管加人50μL矿物油，短时间低速离心让矿物集*在上层。再将反应管置于PCR扩增仅。光94℃预变性，再94℃min50mit2℃1rnin，次循环，然后72℃8min，最后4℃保温。
6.6琼脂糖电泳
用TBE电泳缓
2%的琼胎糖（食1\g/mEB,见第A.8章)平板。将平板A,4章)配
改人水平电泳槽，使随塞静液刚架加入样品孔：在电漆对设量DNA
约0.5h，当溴酚蓝
6.7 套式 PCR
如果 PCR
DNA带，只是要
然后依次旅
10倍浓缩的缓
每管加入
先预变性,再 9喝
6.8对照的设
部时停
电泳时看
步核实，
下试剂：Ta
#0 μl，25 m
矿物油。
min-50
6.8.1在6.1的择
处理过程中
6.8.2取含有已制V考
6.8.3敢正常的继脏薄作为顾
猎，敢5uL斤
的氢化镁（MgCl210
取等体积的基好餐模板作
舒空白对照
7结果判定
uL样缓冲藏（见第A，9章）混匀后19 DNA/MspkHpelI>, 5 V/crn 电泳结果。
交：如果PC餐后影物电泳时能看到做模板
5L和引摄F5μL，Taq酶用
精水到总体积为10uL。
层。再将反应管于PCR扩增仪。
然后 72 ℃8 mix,最后 4 ℃保温。对照。
得药没有.CPE出现，则结果判荫性：套CPE出现，则要用RT-PCR方样品经过接种细胞和膏
法进行鉴定是否山SVCV引起
PCR后阳性对照会出现一条7Pbp的DNA片段。阴照和空白对照没有该核酸带。套式PCR 后阳性对照会出现一条 606 bp的 DNX芹段\性对照和究白对照均没有该核酸带。待测样品PCR扩增后能在相应714bpDNA位置.上有带，并且套式PCR扩增后能在相应606bp位置上有带；或者虽经PCR扩增后可能因度太低看不到可见的DNA带，但套式PCR扩增后能在相应606bp位置上有带者，均可判为阳性。无带的判为阴性。仅在PCR扩增后有714bp的DNA带，但套式PCR重复两次仍不能扩增出606bp的DNA带的样品也判为阴性。如果扩增出的DNA带的大小不是·714bp与606bp应判为阴性。如果带的大小和阳性片段接近难以确定，则需要测序，根据是否和凹知DNA片段的序列晰合米判定。3
GB/T 15805.5—2008
黯录A
（规范性附录）
试剂配制
标准中所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。A.1 CTAB溶液
按 CTAB(hexadecyl trimethy ammonium bromide)2%,氯化钠(NaC) 1. 4 mol/L,EDTA 20 mmol/L.Tris-HCl 20 mmol/L pH7.5配制。用前加巯基乙醇至整浓度为 0.25%。A. 2抽提液 1
将三氯中烷：异戊按24：1的比例混合，密闭避光保存。A3抽提液2
1 mol/L Tris水溶液饱和的酚：三氯中烷：另戊醇一2524I混合，密闭避光保存，A.4TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液）Tris
硼酸（HBO:）
1000mL
用 5 mol/1. 的盐酸(HCI)调到 pH 8. 0A. 5 逆转录酶 AMV 的 5 倍浓缩缓冲液Tris-HCI
氟化钾(KCI)
氯化镁（MgCla）
A.6氯化镁(MgCl2)溶液
浓度为 25 mmiol/L。
250 mmol/L, pH 8, 3
250 mmol/L
50 mmol/LwwW.vv99.Net
50 mmal/L
A.7T酶用 10 倍浓缩缓冲液
Tris-HCl
氯化钾（KC
Trilon X-100
500 mmal/LpH 8. 8
500 mmol/L
A. 8EB(ethidium brumide，核醉染色剂)用水配制成 10 mg/mL的浓缩液。用时每 [0 ml.电涤液或琼脂中 1 μL。A.9样品缓冲液
每100mL水溶液中含：漠酚蓝0.25g：蔗糖40g。A,10细胞培养液
TC199培养基，按说期书的要求配制。然后加入10%的胎牛血清，抽滤除菌，一20℃保存，A
TTKAONTKAca
附录B
(资料性附录）
SVC病毒G基因全序列(1588bp）
GB/T 15805. 5--2008
laacagacatc
atgtctatca
cgeattcett ttgctaattg actecaactttagctacat
61 aggaatccce
catrtggtcg aaatatatca tggcagcctg tgattcagccatatttgttc
121 atttgattat
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catctgtattcagtacagat aaagtgtctg gatggatctg241 ccatgcagct gaatggaaaa caacttgtga ttat ce 301 agtatt catecgatca gtcctaccat agatgaatgc agkagaatca ttcaaaggat361 tgcatcaggg actgatgag at r ggat gggcatcigt4zl cacacggtg tcaaatacta: allatagagt agtaccccat lctgttcatt tagagccata481 cggaggacat tggatcgatc acgaatttaa tgggggcgaa tgcagagaas aagtgigcga54l aatgaaaggg aatcactcta ttggatcac agaggagact gtacagcatg agtgigcaaa601 acatatagag gaagttgaag gaattatgta cgggaatgtt ccaagagggg atgtaatgta66l tgctaacaac tttattatagatagacatca cagagtatac agattcgggg gatctigtca721 gatgaaattc tgtnataaag alggtataau attcgcgaga ggagactggg tagaganaac78l agccggaaca ttaacaacga ttcatgacaatgtgcctaaa tgtgttgatg gaargitggt841 ctccggtcac cgccccggat tagacttgat tgacacagtc ttcaatttgg aaaatgtagtg0l ggaatatact ttgtgtgaag ggactaaaag gaaaatcaat aaacaagaga agctgacate96l agtg e akeatt l at cggagkettc ggatcagtat ttagagtgag1021 aaacggaaca ttagagagag ggagcactic ttatatcaag atcgaagtag agggacctat108l tgtcgactcg ttaaatggga cagaccctag aactaacgcc tcaagagtat tctgggatga1141 ctgggagtta Ralggcaata tataccaggg tttaatggt gtatataag ggaugatgg1201 gaagatccat atecctttga
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ctcatcagat
tigcacttat
gctgtgttgc
ttgatgaagaggagtaaact
1501 gcctgcaaca gaateacacg auatgcggte tttagtttga gagacagcag attaccaaga1561 tattatctca
atagatgtat gaaaaaaa
注：涂墨和划线处为引物序列。5
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