本标准规定了滑石粉的微生物学检验方法及范围。 本标准适用于医药、食品及化妆品用滑石粉的微生物学检验。

中华人民共和国建材行业标准
JC/T542—94
滑石粉微生物学检验方法
1994-03-26发布
国家建筑材料工业局发布
1994-12-01实施
中华人民共和国建材行业标准VV99.net
滑石粉微生物学检验方法
主题内穿与适用范围
本标准规定了滑石粉的生物学检验方法及范围。本标准适用于医药、食品及化妆品用滑石粉的微生物学检验。2术语
JC/T 542—94
菌落总数：指样品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落总数。3检验通则
3.1取样及注意事项
3.1.1每批滑石粉应随机抽两个或两个以上包装完好的单位，试样量不少于10g以使检验结果具有代表性。
3.1.2凡异常的供试品，则选取有疑问的样品进行检验。凡包装开启可见霉变的、无须检验即可判为不合格。
3.1.3在检验前，应严格保持包装的原有状态，防止再污染。并放在阴凉干燥处。防止因微生物再繁殖而影响捡验结果。凡原包装已启开，则无代表性。3.1.4样品的稀释，须在1～2h内完成，以防止微生物然殖或死亡。3.1.5微佳物检验全过程，必须在尤菌操作条件下进行，凡直接与样品接触的用具，均应事先灭菌并保持无菌。
3.1.6从样品检出致病菌的报告发出之日起，该菌菌种需保存一个月备查，阴性样品可及时处理。3.2供试液制备的材料和仪器
天平：感量0.1g：
三角烧瓶：300mL或500mL
玻璃珠：5mm，
量筒：100mL；
电炉；
F高压消毒锅
滤纸。
3.3供试液的制备方法
称10g试样，放入装有90mL稀释剂（生理盐水）和十几个玻璃珠的三角烧瓶中，经振摇制成1：10的试液备用。取用时必须混匀。3.4阳性菌株对照试验
3.4.1每次检验，应同时进行阳性对照生长试验3.4.2对照试验加入的已知活菌量，每批样品应控制在50～100个范围之内。3.4.3常用的阳性对照菌株，卫生部检定所编号：大肠杆菌44102、绿脓杆菌10104、金黄色葡葡球菌国家建筑材料工业局1994-03-26批准1994-12-01实施
bzsos0COm26003等。
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3.4.4作阳性菌株对试验时，应注意安全，严格防止对照菌污染样品和环境。4细菌总数测定方法
4.1方法原理
每种细菌有它定的生理特性、生长时对营养、温度、时间、PH、需氧性等的要求均不相间。在实际培养中，不可能同时满足所有细菌的要求，因此只能测定在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧及兼性厌氧的细荫菌落总数
材料和仪器
恒温培养箱，
电热恒温永浴锅；
移液管：1mL及10mL；
平血490mml
试管18mm×200mm;
试管架，
放大镜。
培养基和试剂
营养琼脂培养基；
生理盐水:定量分装于试管(每支试管内 9mL)试验程序
1:10试液
做几个连续倍数的稀释液
选择2~3个连续稀释度，各加1mL于相应平血平血加入12-15mL营养琼脂
36±1c148±2h
菌落计数
4.5试验步骤
试液稀释及培养
4.5. 下用 1mL移液管取1：10 试液1ml,浩管壁加大盛有 9mL盘水的试管(管的尖端不要触及液面），振摇试管，作成1100均匀稀释液。4.5.1.2另取1mL移液管，按上述（4.5.1.1)操作制10倍递增稀释液，每次更换支移液管，稀释至10-3～10-倍。
4.5.1.3选择2～3个连续稀释度，用吸取该稀释度的移液管，移1mL试液于平血内，每个稀释度作2～3 个平血。
4.5.1.4将预先放在45士1C恒温水浴中的营养琼脂培养基，加入平血约15mL，并转动平血混合均匀。同时再将营养琼脂15mL倾斜加入装有1mL不含试样的释剂平血中，作为空白对照。4.5.1.5琼脂凝固后，翻转平血，置36士1℃培养箱内，48士2h取出进行菌落计数。平血菌落数乘以稀释倍数，即为每克样品所含菌落总数。.4.5.2计数方法
4.5.2.1用肉眼观察，必要时用放大镜。JC/T 542—94
4.5.2.2求出同一稀释度各平皿的菌落平均值。若平血中有连成大片的菌落生长，该平血不宜计数。若片状菌落不到平亚的一半，其余一半的分布又很均句，可将此半个计数后乘以2，代表全Ⅲ。4.5.2.3选择平均菌落数在30～300之间的平血，作为菌落总数的测定范围。当只有个稀释度符合此范围，即以该平血菌落数乘以稀释倍数(见下表中例1)。4.5.2.4有两个稀释度，平均菌落数均在30~~300之间，则应求出两者菌落总数之比值决定。小于或等于2.报告其平均数，大于2则报告其中较小的菌落数（见下表中例2及例3)。4. 5. 2. 5
中例4岁
4. 5. 2. 6
中例5)%
所有稀释度，其平均菌落均大于300个，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见下表所有稀释度的平均菌落数均小于30个，则按稀释度最低的平均菌落数乘以蒂释倍数（见下表所有稀释度的平均菌落均不在30～300个之间，则以最接近30或300的乘以帮释倍数（见下4. 5.2. 71
表中例6）。
4.5.2.8所有稀释度均无菌落生长，为每克小于10个。4.5.3报
菌落数在100以内，按实有数值报告，大于100，采用二位有效数字乘以10的指数来表示，有效数字后面的数值用修约法处理。以弃/名为计量单位。细菌计数结果及报告方法
不可计
不可计
不同希释度的平均菌落数
雾菌和酵母菌数测定方法
方法原理
两稀释度
菌数之比
菌落总数
513000
报告方式
1.6×10°
3.8×10°
真菌具有明显的细胞核，多数需氧，在偏酸含糖的培养基、较高湿度和25～28℃的温度条件下生长良好。本方法根据这些生物特性，进行培养和菌落计数。5.2
林料和仪器
恒温培养箱，
振荡器；
电热恒温水浴锅：
试管，15mn×150mml
移液管，ImL.和10mL，
平血：990mm，
生物显徽镜；
载玻片、盖玻片。
5.3培养基和试剂
虎红琼脂培养基：
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蒸馏水：定量分装于试管（每支试管9mL)。b.
5.4试验程序
1:10试液
1摄落30min
做几个连续倍的帮释造
选择3个连续弊度，各加1mL于相应平血每血加入12～15mL培养基
25 --28'C172h
随落计数
5.5试验步骤
试液稀释及培养
将1：10试液置振藩器中，振荡30min，使菌孢子充分散开。按细菌总数测定4.5.1.1~4.5.1.2中规定的稀释方法，稀释至10-~10-4。5.5. 1.3根据试样污架程度，选摔 3个连续稀释度，分别移1mL稀释液于相应平血中。每个稀释度做2～3个平血。.然后将预先放在水浴锅中的45士1℃的虎红琼脂培辨基，分别加入约15ml.,并转动平血，混合均匀。同时按细菌总数测定中的方法，做空白对照。5.5.1.4待琼脂凝固后，倒置于25~~28℃培养箱中，72士2h取出进行菌落计数。5.5.2计数方法
用肉眼观察，选择同一稀释度平均菌落数在5～50个之间的，乘以稀释倍数，作为霉菌和酵母菌总数。计数和报告中所遏到的各种情况，按细菌总数测定4.5.2中的规则。注，计数时，如不能背定是承菌和醇母菌，可取培举物淤片直接镜检或革兰氏染色后境检。6大肠菡群、粪大肠菌群检验方法6.1方法原理
根据其所具有的生物学特性。如苹兰氏阴性无芽胞杆菌-分别在 37C和 44℃、24~48h 能发酵乳围、产酸、产气，并能在选择性培养基上产生典型菌落，能分解色氨酸产生靛基质等6.2
材料和仪器
恒温培养箱：
电热恒温水浴；
试管及小倒管：15mm×150mm：
移液管，1mL，10mL，
平Ⅲ：990mm；
pH试纸：
生物显徽镜！
载玻片和盖玻片。
6.3培养基和试剂
乳糖胆盐培养基
伊红美兰琼脂(EMB)
.c,
兰氏染色液；
蛋白豚水，
靛基质试剂1
乳糖发酵培养基。
6.4试验程序
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1:10试液
做三个连续稀释度
乳糖胆盐发酵管
36 ±1℃ + 48h
不产酸、不产气
6.5试验步骤
6.5.1试液稀释
产酸、
乳糖胆盐发醇管
不产酸、产气
证实试验
JEMB平板
产酸、产气
靛基质试验
EMB平板
36 ± 1 C ↓ 24 h
染色镜检
乳糖发酵
用1：10试液，接细菌总数测定4.5.1.14.5.1.2中的方法做10倍递增蒂释液。6. 5. 1- 1
6.5-1.2根据样品的污染情况，选择三个连续稀释度。6.5.2大肠菌群
6.5.2.1将试液分别接种于预先装有10mL乳糖胆盐培养基的试管内，每管1mL，每-稀释度接种3管，置36土1℃培养48h，如所有试管内都不产酸，不产气，则可报告大菌群阴性。如有产气、产酸者则需接6.2.2进一步做证实试验。
6. 5. 2. 2
划线接种于EMB平血，置36土1℃C，培养18～24h，取出观察形态，挑取可菌落做染色镜检，同时做乳糖发酵试验，凡乳管产气，镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，即可报告大肠菌群阳性。6.5.3翼大肠菌群
6.5.3.1将第一产酸、产气的乳糖胆盐培养物，分别以1mL接种于各乳糖胆盐发酵管内，置44土0.5℃水裕锅，培养2428h。如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸，不产气，则可报告粪大肠菌群阴性，如产酸产气，则进行6.5.3.2～6.5.3.5程序。6.5.3.2划线接种于EMB平血，36土1℃培养18～24h，同时接种于蛋白陈水，置44±0.5C培养24h。
6.5.3.3经培养后，在EMB平血上典型大肠菌群菌落，呈深紫黑色，圆形、边缘整齐，表面光滑湿润。带见有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落。6.5.3.4挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。6.5.3.5在蛋白陈水培养液中，如入靛基质试剂0.5mL，阳性反应则液面呈致瑰红色，阴性反应液面呈试剂本色。
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6.5.3.6平血上有典型菌落，经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则报告粪大肠菌群阳性。7绿脓杆菌检验方法
7.1方法原理
根据本菌生物学特征；革兰氏阴性杆菌、氧化酶试验阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐。在：42℃条件下生长等，可与类似菌相区别。7.2材料和仪器
恒温培养箱；
冰箱：
三角烧瓶：500mL，300mL
试管：18mmX200mml
平Ⅲ：490m
移液管：1ml，10mL;
生物显微镜；
载玻片及盖玻片
接种环及针
酒精灯。
7.3培养基和试剂
营养琼脂培养基(普通肉汤培养基);：十六烷三甲基溴化铵培养基：乙酰胺培养基，
绿脓菌色素测定用培养基
明胶培养基，
硝酸盐蛋白豚永培养基;
1必的二甲基对苯二胺试液；
三氯甲烷(氯仿)
1mol/L 的盐酸。
试验程序
7. 5试验步骤
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1=10试液
普通肉汤培养液，增菌
37c18 -- 24h
十六烷兰甲基溴化铵培养基、分离培养37 ℃+18 ~ 24 h
普遁肉汤培养基、纯培养
37118 ~24 h
染色镜检
生化试验
极化试验
7.5.1增菌：取1：10试液10mL，放入装有90mL普通肉汤培养液的三角烧瓶中，在37C下培养18~24h，有绿脓菌生长时，培养液表面多有一层薄菌膜，且呈黄绿色或蓝绿色。7.5.2分离培养：挑取增菌培养物，划线接种在十六烷三甲基漠化镂琼脂平血上（也可划线接种在乙酰胺培养基上）。在37培养18～24h，在培养基上，菌落扁平无定型，呈灰自色。向周边扩散或略有蔓延、表面湿润，周围的培养基常扩散有水溶性色素(在乙酰胺培养基上，菌落扁平、边缘不整齐，周围的培养基略带粉红色，而其他菌不生长）。7.5.3纯墙养：挑取可疑缘脓杆菌的分离培养物菌落2~3个放入肉汤培养基，在37培18~24h。7.5.4染色镜检：挑取可疑菌落、片、革兰氏染色，经镜检为阳性若，进行氧化酶试验。7.5.5氧化酶试验：取一小块白色滤纸，放在平皿内，用玻璃棒挑取绿脓杆菌的可疑菌落，涂在滤纸上，加1滴新配制的一甲基对苯二胺试液（1%），30s内出现粉红色或紫红色，为阳性，若培养物不变色，氧化酶试验为阴性。
绿脓杆菌试验：取可疑菌落2~3个，分别接种在绿脓菌素测定塔养基上，在37C赔养24h，加入7.5.6
氯仿3~5ml.，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于氧仿液内，待氛仿提取液呈蓝色时，用移液管将氟仿移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL左右·振后静置片刻。如上层盐酸滩内出现粉红色到紫红色时为阳性，说明样品中有绿麟菌素存在7.5.7硝酸盐还原产气试验挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盐陈水培养基中，置37℃培养24h，观察结果。凡在硝酸盐陈水培养基内的小试管中有气体者，为阳性。表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氧气。
7.5.8明胶液化试验,取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物穿刺接种在明胶培养基内，在 37℃培养 21h取出放入冰箱（a～4C）10～30min，仍呈溶解状，为阳性，凝固不溶解者为明胶液化试验阴性。7.5.942C生长试验：挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，在42士1℃，培养2448h，绿杆菌能生长为阳性。
7-6试验结果：试样经增菌、分离培养，证实为革兰氏阴性杆菌，机化酶及缘脓菌素试验均为阳性者，样品判为有绿脓杆菌；绿脓菌素试验阴性而液化明胶，硝酸盐还原产气和42℃生长试验皆为阳性时，仍判bzsosocm样品中有缘杆菌。
8金黄色葡莓球菌检验方法
8.1方法原瑚
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根据本菌的特有形态及培养特性，应用Baird-parker平咀进行分离，该平匪中的氟化锂可抑制革兰氏阴性细菌生长，内酮酸钠可刺激金黄色葡球菌生长，提高检出率，并利用分解甘露醇和癌浆诞固等特征，以兹鉴别。
材料与仪器
生物显微镜！
恒温培养箱：
露心机；
移液管：1mL、IUmL：
试管：5mm×150mm，
角烧瓶：500ml.或300mL;
载玻片，盖裘片;
接种环或针：
酒精灯。
和增养基
7.5%的氯化钠肉汤
Baird-parker平血；
血琼脂培养平通；
甘露发酵培养基；
遵浆。
8.4试验程序
1=10试验
7.5%的氨化钠肉汤、增菌
36 ±1 ℃1 24 h
Baird-parker平m、分离培养
36 ±1C 24 ~ 48h
血原脂平血、纯培养
36±1℃+24h
染色镜捡
8.5试验步骤
甘露醇发醇试验
血浆凝固酶试验
B.5.1.增菌，取110试液10mL，放入装有90ml7.5%的氯化钠肉汤的三角烧瓶中，在36士1℃培养24h。有金葡球菌生长，肉汤变成浊状。8.5.2分离培养：从增菌培养液中取出1～2接种环，划线接种在Baird-parker乎血上，在36士1℃培养24～48h。Baird-parker平血上有圆形光滑凸起，湿润直径为2～3mm，呈灰色到黑色，边缘色淡，周面呈·浑独带，外层有一选明带。无Baizd-pazker培养基可划线接种在血琼脂平耻上培养。谊琼脂平血上的菡落呈金黄色，大丽突起，圆形不透明，表面光滑，周有溶血圈。JC/T542—94
8.5.3纯培养：从分离培养血上,挑取单个疑似菌落接种于血琼脂平血上,在36土1℃下培养24h。8.5.4染色镜检：挑取纯培养的疑似菌落进行涂片和革兰氏染色、镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成葡葡状，无牙胞，无英膜。致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.5～1m。8.5.5甘露醇发醇试验，取纯培养菌落接种到甘露醇发醇培养基中,在36士1℃培养 24h。金黄色葡萄球菌能发醇甘露醇产酸,培养基呈红色。8. 5. 6血浆凝固酶试验,吸取 14 的新鲜兔血浆 0. 5mL,放入试管,加人待检的增菌 24h 肉汤培养物0.5mL。混勾后放入36土1℃的培养箱或水浴锅中，每半小时观寨一次，24h之内呈现凝块，为阳性。同时用已知血浆凝固酶试验阳性和阻性菌株，作为对照8.6试验结果
上述选择平血上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露酶产酸，血浆凝固酶试验阳性者,表明样品中有金黄色葡萄球菌。MJC/T 542-94
附录A
微生物学检验的有关培养基和试剂（补充件）
A1营养琼脂培养基（肉汤琼脂培养基）成分
蛋白藤
氯化钠
牛肉面
燕馏水
1000mL
将蛋白陈、氧化钠，琼脂、牛肉膏加到蒸馅水中，微温使溶，再加热煮沸，待琼脂完全溶化后，混勾，用1mol/L Na(pH 溶液调 pH值为7.4士0.2,过滤，分装于二角烧瓶，经121,高压灭菌20rmin 后，存丁0~4℃冷暗处备用。
虎红琼脂培辨基
蛋白陈
葡萄糖
磷酸二氢钾
硫酸镁(MgS04·7HO）0.5g
4/3000虎红水溶液
蒸馏水
将上述（除虎红水溶液外）各成分，分别加于蒸馏水中，加热溶解，过滤，再加入虎红水溶液（四氯四碘荧光素溶液），同A1中b项分装后.在121高压灭菌20min。A3
乳糖胆盐培养基
蛋白藤
猪朋盐
0.4%溴甲酚紫水溶液
蒸馏水
1000mL
将蛋白陈、猪胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH值为7.4，加入指示剂(0.4%激甲酚紫水溶液）混匀，分装于有小倒管的试管中（见A12中b项），置于115℃高压灭菌20min。A4伊红美兰(EMB)琼脂
wh.
蛋白陈
磷酸二氢钾
2%伊红水溶液
0.5%美兰水溶液
蒸馏水
JC/T 542-94
1000nL
先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后入磷酸二氢钾、蛋白陈混匀，使之溶解，再以蒸馏水补足李1000mL，调pH值为7.2～7.4，分装于烧瓶内，在121C高压灭菌15min后备用。用时，加入乳糖并加热融化琼脂，在60℃左右以无菌手续加入灭菌的伊红、美兰溶液，摇匀，倾注平使用。A5蛋白陈水
蛋白藤
氯化钠
蒸馏水
1000mL
将上述成分加热熔4化,调 pH 值为 7. 9~7. 2,分装小试管,经 121 ℃高压亚菌 15hin 。A6髋基质试剂(柯凡克试剂)
对二甲氨基苯甲醛
滩盐酸
将对二甲氨基苯甲醛加入戊醇中，搅动使之完全溶解，然后1滴1滴缓慢地加入盐酸25mL。A7
草兰氏染色液
染液制备
结晶紫染色液
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸溶液混合。A7.1.2革兰氏碘液
碘化钾
蒸馏水
.
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