备需号：2744-1999
中华人民共和国行业标准
BE7F103171990
蛋白酶活力测定法2 X803-87
Measurement af protelnasc iciivlty本疗法道月于酿虚酱浪时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。1袜法
1.1，试及资液，以下试前都为分析纯1-1.1试剂（Foi试剂），于20tUm磨口回流收内，加入码酸钠，(NWO，-2HO）1Ug相酸钠（NoMo0，·2H0）25g+蒸水700mL，85%叠酸50rrl.，浓盐酸1mE、文火回流1uh。取去冷观露，加人疏酸（Ti,S0）g，蒸馅水0，划几滴液伴澳，再素滞15min，以驱斑残及除去题色，溶浓应呈黄色而非继色：若溶液仍有绿色，需要再时儿滴离液，再意除去之。冷却后，定穿至1000mL，用红南涌斗（K04--5）过，贸棕色保在.此落液性用时加2倍蒸阅承籽，呼成己稀释的魅试剂。
1.1.20.4rmal嵌酸钠落液：称取无水碳酮钠（N)）42.%，定等至1kiomT.1.1.30.4ml三熟乙醛（TCA）熔液：称取三氯乙酸（CCICXTI）65.4g，定至1000ml1.1.4pH7.2酸益线冲液：弥收磷酸二氢的（NaH,FU,·2Hz0）31.2g：定容垒1000mL，迎成0.21ol帝落（A夜，称驱链醛氧二销a,HPO,：12H,0）71.63g，定容至1200ml.，即盛0.2ml溶泌(B鞍）.
取A液28ml和B液21rL，再月蒸饱水整1倍：即成.1riulnH7.2的薛酸蓝缓冲液，1.1.52收酷量户密滤：谁确称取酪豪28，称准至0.002g，加人0tN氧化销10mL在冰抢中加热使资解（必要时用小火加势素递），需广用PH7.2睡酸盐级凉遮定穿至100mL即感，配制后应及时使甲或效入冰箱内保件，否则极易紫殖细曲，引起逐质，1.1.6100g/mT.酪氢酸核；精确称取在105C灶箱中烘至恒重的氨酸.10g，逐步加入fim[.1N益融使溶解，用.2N益容至100mL.其求度为1000格/mL+再吸取此滤10ml.，以0.2N益酸定穿至100ml，即配成100/m的酪敏醒激离，起游度配或后也应及时使或放人冰销内保存，以免素殖细菌而变质。
1.2仅器
日，分析天半，感量0.1mg
b.581G型光电比色计或72型分光光度计：C.水浴锅；Vv99.net
d.1、2、5、100ml.移液管等。
1.3操作
国家国内贸易屑1989-04-15批者230
1999-04-15实能
L.3.1标准曲线的偿制
SD08171M
t.3.小！按下表配制各种不同浓度的酪氨酸掩液（表1)，表1
黄铺术，mL
1eg/L 随究，btL
数酸最资依乐，rg/al
配制各种不同浓度的酷氨酸溶液营
[.31.2测定步骤：取5支试管编号按表1分辨吸吸不同度酪氨酸1mL，各加人心.4ml碳酸筛5mL，再各加入已稀释的格林试剂1ml.据匀登十水钢中，40C保摄发色20min在581G型光电比色计上分别测定光裤度(OD）（幽片用65\）或用72型分光光度计进行别定（被长660nm）。一轻测三次，取平均值。将1～号管所洲得的光密度（OD）减去1号等（熬瘤水空白试验）所测得的光谢度为净OD微
为了清楚起见，再列出表格如下（表2)。表2
技岁1制备不同然应酪氧酸，mL
o.4mol/l.Nnt:D,ml
益林证剂，正
净OD值
以净UD值为横坐标，略熟够的浓度为纵坐标，绘制成标推曲线（或可求出每度UD所相当的酪氢酸量K!
1.3.2样总帮释减的制备。
1.3.2.1测密酵带剂：称取醇极0.100%，入pH7.2磷酸性超冲液究穿至110ml.吸致液5ml.再用缓冲酸稀群全2ml.即成50叫倍的粉稀释滤。1.3.2.2谢定成典降：称收充分研细的成曲5g，加水率100m，在40水游内断挽拌1h，过滤，涉滩开0.1molpH7.2瞬曾盐缓冲能带释到一定危数（估计酶括力而忘），1.3.3样品测定：取15×100m日试管3支，编号1、2、3（做2只也可）、书管内加入样品帮释液1ml，置了z0水浴中所热2rmi，再各划入经同样预热的蛋白lmT.精确保温10min，时间到后，立即再各加入0.4mDl一实乙酸2l，以终止反应、维续置于水中保温20min，使残余蛋户质沉淀后离心或过源，然后另取15×150mm试件3支，确号1.2.3，每等内如入谈范1ml，再加0.4mol磁酸钢5mL，二稀释的福达试剂1mL摇勾，fCC保温发色20min后进行光密度（CD）测定。251
8BT017-1
空自试验也取试管3支，缩号（1），（2），（37，测定方法同上，唯在加口之前先加0.4mril三氯乙醛ml，使酶失活，再加人酷蛋。为了清整起见，分别列出表将于下（见表总表4。3
尿热群液，ml
减热2分强白，m
作用1omin（精确计时）
0. 4msl 三减乙附、αl.
0.4aoi NBaC+ mL
根林试剂，l
平均)位
净0办佰
放热降滤，rJ
c.4mnl 三斯乙,αl.
作川0mmin（物确计）
2亡，L
样品的平均光密度(O)）一空白的平均光密度(O）一净()值1.4计算
在40心下每分钟水蛋白产牛1醛氢敢，义为！个白酶活力单位，(2)
X4XNX1-W
样品蛋白醇活力单位（工著）
式中，A一由样品测存OT)值，查标准曲战得相当的醛氨酸微克款（或D)值文K?：4--4毫升反应液取出1ml.测定（即4赔）;N-：静液筛性的倍数：
10——成10min
V—样品水分百分贪量，
1.5注意事项
以上外绍的方法用于测定中性蛋白醇（PH了.2)。将要融定酸性酶或减性蛋酶，则把配制酷蛋白溶液和希释液用的缓冲滤换成相应H缓冲游即可。现把几种学甲pH瞬冲液配方提供如下：
1.5.1pHz.5磷醇盐冲滤(>.02mol/1.)称取磷啤氢二钠（NaHPO,-12H,0）6.02g和磷酸二钠NaH,PO,-2H,Q).5g以蒸临水滴232
解定券至1Mnml.
HE/T10817-1009
1.5.2pH2.5噬--乳酸钠滋冲液(0.05mmml)A滤，称取80%~90%乳酸10.6%，加蒸细水筛释定套至1mmHml.月液，称取0%乳腰销16g，加水筛释定容笔100mL。坡A16ml.与B波1mL准合税释-倍成：1.5.3μH3.个乳载-乳酸钠缓冲液（0.0m1）A液，称吸80%--90%像10.6g，必水定穿车10c0mLB疫：称取了0%乳酸钠16g：说水熔解定穿至100CmL取A筱 Bml. 与 R液 1nL：混合稀样 -告即成。1.5.4pH10硼砂氢化锈冲被
A滤，取调砂19.08g，用蒸水游解定容率1000mL(0.05mm0l).B减：称取氢满化钠8g，用热增水落群定穿至1000mL(0.2NV)。取A粮230mI.、乃被21EmT.混合，用蒸馏水稀释宽奔至130mT.成：1.5.5PHI1.0调砂主化的短冲液
A液：称取砸秒19.08g，用燃增术定率至1000ml..B获：剂取氧化纳多，用蒸焰水定容至mT.收A液与B商等量滤合。
1.5.62%酷蛋口降液配成酸性时，须先刘数滴涨乳酸。之湿润以加速其熔解。2甲醚法
成曲蛋白酶活力的测是，如用相林法测定确有国难时：可用甲猫法测定作过被，、疫器
a.分析天平：感量0.01g+
b.水裕綫；
r电烘箱：
d.容量瓶、啵管、滴定管等。
2.1试剂与路液
a.1%酚搭示剂：
b.0.1%府香草龄蓝；
5.0.1V多氧化钠滤，用擎【试剂配法同氢款效的测定，见B/5009.3-199要相态测定港
2.3 操作
23.1日酬法
称取研细均匀的成曲样品1g，放入25aml.样形瓶中，加55溢水8mL，充分摇句，留于55水举中保温35，取出后加热点席以酸坏海活力，冷知后定容至100L：充分播习后以脱踏桐过滤：吸联滤液10ml.，移至150ml.锥形板巾，加水50mL，1%随改措示：0.2mL.以0.1V氢氧化的标熔镀滴定至喇显微红色（pH8.2).记下满定数作为总酸，维终切中酵10ml.，用0.1M氢氧化纳减滴定至深红色（pH8.5）为终点，若乃拍府香草臀蓝[mL作指示剂：则滴至紫红色为终点。记下滴定数：减去空白教后计算成领基氮见称取曲10g做水分，再折算成下基数，3.3.2酸度计法
所用仪器，药品、微作方法等与氢基态氮到定法同（见/T509.21-196）。2.4计算
S/T10017-180
选自要活力（克氨基甄/0H）（干基）式中：V-
(V-*V,) XNX0.a14
加入甲醛后氢氧化钢标准液滴穿数，mL甲酵空白滴定数，mL
曲水分·%；
氨氧化钠标准溶液的当母数，N
附加说明。
筑的毫点当量数，
本标确出国家国内贸易，局提出。本标难由上海市道科学研泛所起草。本标窄主要起草人须风高，
车所上在一定出度下，一定时间内，成商利川自的买白脚户原中的置白本解次低基映，以更定基在氧的量法量白的致位，有和堆较程，还境谨和自含分，故作以量收生，，能次的的活进行照可用以扣即此语，方法是南样平开即将成出耐循乐及，其余作活课全性网，方是把己有的，，的空
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