本标准规定了烟叶中游离氨基酸的氨基酸分析仪测定方法。 本标准适用于烟叶中天冬氨酸（Ａｓｐ）、苏氨酸（Ｔｈｒ）、丝氨酸（Ｓｅｒ）、天冬酰胺（Ａｓｎ）、谷氨酸（Ｇｌｕ）、脯氨酸（Ｐｒｏ）、甘氨酸（Ｇｌｙ）、丙氨酸（Ａｌａ）、缬氨酸（Ｖａｌ）、胱氨酸（Ｃｙｓ）、异亮氨酸（Ｉｌｅ）、亮氨酸（Ｌｅｕ）、酪氨酸（Ｔｙｒ）、苯丙氨酸（Ｐｈｅ）、β丙氨酸（βＡｌａ）、β氨基异丁酸（βＡｉａ）、γ氨基丁酸（γＡｂａ）、赖氨酸（Ｌｙｓ）、组氨酸（Ｈｉｓ）、色氨酸（Ｔｒｐ）、精氨酸（Ａｒｇ）等２１种游离氨基酸的测定。

ICS65.160
备案号：25965—2009
中华人民共和国烟草行业标准
YC/T282—2009
游离氨基酸的测定
氨基酸分析仪法
Tobaccoleaf-Determination of dissociated aminoacids-Aminoacidsanalyzermethod
2009-03-30发布
国家烟草专卖局
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B、附录C为资料性附录。本标准由国家烟草专卖局提出。YC/T282—2009
本标准由全国烟草标准化技术委员会卷烟分技术委员会(SAC/TC144/SC1)归口。本标准起草单位：湖北中烟工业有限责任公司、中国烟草总公司郑州烟草研究院。本标准主要起草人：王娟、李丹、刘建锋、马舒翼、宋旭艳、郭国宁、刘克建。I
1范围
烟叶游离氨基酸的测定
氨基酸分析仪法
本标准规定了烟叶中游离氨基酸的氨基酸分析仪测定方法。YC/T282-—2009
本标准适用于烟叶中天冬氨酸（Asp)、苏氨酸（Thr)、丝氨酸(Ser)、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸(Glu)、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、颂氨酸（Val)、胱氨酸(Cys）、异亮氨酸（Ile)、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）)、苯丙氨酸（Phe）、β丙氨酸（βAla）、β-氨基异丁酸（βAia）、-氨基丁酸（-Aba）、赖氨酸(Lys）、组氨酸(His)、色氨酸(Trp)、精氨酸（Arg)等21种游离氨基酸的测定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。YC/T31—1996烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
烟叶中游离氨基酸dissociatedaminoacid(freeaminoacid)intobaccoleaf烟叶的盐酸浸出物中，以游离状态存在、未结合在蛋白质分子中的氨基酸。4原理
氨基酸为两性电解质，在酸性环境下形成阳离子。烟叶中的游离氨基酸经酸溶液萃取后，经氨基酸分析仪的磺酸型锂离子交换柱分离，然后与三酮混合，通过加热反应，伯胺与之生成蓝紫色化合物，仲胺与之生成黄色化合物。两种衍生物使用波长分别为570nm和440nm的双通道紫外检测器同时进行定性定量分析测定(氨基酸分析仪管路图参见附录A)。5试剂
除特别要求以外，本标准所使用的试剂均为分析纯试剂，水为去离子水。5.1盐酸溶液，0.005mol/L。
准确移取420μL浓盐酸（质量分数为36%～38%）于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。此溶液作为萃取溶液。
5.2样品稀释液，pH2.20。
准确称取四水柠檬酸三锂11.3g，柠檬酸6.0g，溶于500mL水中，然后加人20mL25%（质量分数）硫二甘醇溶液和15mL32%（质量分数）盐酸溶液。转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。5.3锂离子缓冲溶液1)
1）锂离子缓冲溶液的配制方法为推荐性的，操作者可根据所使用仪器的情况自行调整。YC/T282—2009
5.3.1缓冲液A,pH2.95。
准确称取四水柠檬酸三锂11.3g，柠檬酸6.0g，溶于500mL水中，然后加人50mL甲醇溶液和9mL32%（质量分数）盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。5.3.2缓冲液B,pH4.20。
准确称取四水柠檬酸三锂18.8g，氯化锂4.2g，溶于500mL水中，然后加人6mL32%（质量分数)盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。5.3.3缓冲液C，pH3.50。
准确称取四水柠檬酸三锂18.8g，氯化锂50=9g=落于500mL水中，然后加人10mL32%（质量分数)盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。5.4钾钠缓冲液，pH5.51。
2g，乙酸钾196.0g，溶于200m乙酸[99%准确称取三水乙酸钠272.0
~100%（质量分数）)中，转
移至1000mL容量瓶中，月水
5.5三酮溶液2)
准确称取三酮
液(5.4)定容至刻度、
5.6还原剂
每1000mL萌
深酸酚2
名，溶于
此溶酸应现配现用。
甲醇中，转移至1000mL容量瓶中，用钾钠缓冲液（5.5)中加人0.2,抗坏血酸
5.7混合氨基酸标准储备液
本标准中所规
5.8混合氨基酸
分别移取-
5nmol/mL20nm
该标准工作溶液在
21种氨基酸的浓度均为1.0μmol/m工作溶液3)
的混合氨基酸标准储备液（5.7），用样品稀释液（5.2)配制成各氨基酸浓度均为L、50nmol/mL
00lnmol/mL、200nm@/mL的系列混合氮基敲标准工作溶液。冰箱内可保存3个
常用实验仪器以
述各项。
旋风式样品磨
Q角筛网。
分析天平：感量
移液器：移液范围为
超声波振荡器：功率具
200μ和200μ~1000μ。
氨基酸分析仪（锂离子系统》同时具有自动进样，梯度洗脱以及双通道紫外检测的功能。高速离心机。
水相滤膜，0.45μm。
分析步骤
试样的制备
按照YC/T31一1996中6.1的要求处理烟叶样品后，通过60目筛过滤制备试样，并按照YC/T31—1996中6.2的要求测定试样的水分含量。7.2测定次数
2）三酮落液的配制方法为推荐性的，操作者可根据使用仪器的情况自行调整。3）系列混合氨基酸标准工作液的浓度范围为推荐性的，操作者可根据操作习惯和所用仪器的灵敏度特点自行调，整，要求至少制备5个工作标准溶减，且样品的浓度应在仪器的线性工作范围之内。2
每个样品应平行测定两次。
7.3样品分析
7.3.1样品制备
YC/T282—2009
称取约1g试样(7.1)于100mL磨口三角瓶中，精确至0.0001g。准确加入盐酸溶液（5.1)50mL，塞上塞子，室温下超声萃取30min。经离心后，取上清液，使用水相滤膜（6.7)过滤后上机分析。7.3.2氨基酸分析仪分析
7.3.2.1按照仪器说明书操作氨基酸分析仪。以下分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适用性。
流动相A：缓冲液A(5.3.1)；
流动相B：缓冲液B(5.3.2)；
流动相C:缓冲液C(5.3.3)；
分离柱初始温度：37℃；
反应管温度：130℃；
流动相流速：0.45mL/min；
节三酮溶液流速：0.25mL/min；进样体积：100μL；
检测器：双通道紫外检测器，570nm和440nm。7.3.2.2
仪器梯度洗脱程序见表1。
样品测定
流动相A/%
梯度洗脱程序
流动相B/%
流动相C/%
用氨基酸分析仪测定系列混合氨基酸标准工作溶液（5.8），得到21种氨基酸的积分峰面积，用峰面积为纵坐标，氮基酸浓度（μg/mL)为横坐标分别建立21种氨基酸的标准工作曲线，相关系数应不小于0.9995。测定烟叶萃取样品，根据样品中氨基酸的峰面积计算21种氨基酸的浓度。混合氨基酸标准溶液和烟叶样品的参考色谱图参见附录B。8
结果计算
按式(1)计算烟叶中21种游离氨基酸的含量。T
式中：
mX(1-w)
样品中氨基酸的含量，单位为微克每毫克（μg/mg)；（1)
YC/T282—2009
样品溶液中氨基酸仪的测定浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V
一萃取溶液的体积，单位为毫升(mL)；样品的质量，单位为毫克（mg）；k-稀释倍数；
一试样的水分含量，%。
以两次测定的算术平均值作为测定结果，结果精确至0.001μg/mg。精密度、回收率和检出限
本方法的精密度、回收率和检出限试验研究结果参见附录10检验报告
检验报告应包括以下肉
识别被测样品露要的所有信息；参照本标准所使用的试验方法；检测结果，包括各单次测定结果及其平均值与本标准规
检测日期
检测人员
的分析步骤的差异；
氨基酸分析仪管路图见图A.1。
流动相A流动相B流动相C流动相D莆三酮ooo
气装置
附录A
（资料性附录）
氟基酸分析仪管路图
一氨基酸分析仪管路图
自动进样器
YC/T282—2009
YC/T282--2009
附录B
（资料性附录）
氨基酸色谱图示例
570nm处混合氨基酸标准溶液色谱图见图B.1。峰面积/mV
混合氨基酸标准溶液色谱图（570nm）图B.1
B.2440nm处混合氨基酸标准溶液色谱图见图B.2。峰面积/mV
混合氨基酸标准溶液色谱图（440nm）120z/min
B.3570nm处烟叶样品溶液色谱图见图B.3。蜂面积/mV
图B.3烟叶样品溶液色谱图（570nm）B.4440nm烟叶样品溶液色谱图见图B.4，SSE
图B.4烟时样品溶液色谱图（440nm）YC/T282—2009
YC/T282-2009
附录C
(资料性附录）
精密度、回收率和检出限试验结果本方法的精密度、回收率和检出限试验结果，见表C.1。表C.1方法的精密度、回收率和检出限试验结果氨基酸
加标浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度wwW.vv99.Net
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
回收率
加人量/(mg/g）
回收率/%
.99.21
重复性/%
定性限/
(μg/mL)
定量限/
(μg/mL)
氨基酸
β-Ala
β-Aia
加标浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
中低浓度
中高浓度
回收率
加人量/(mg/g)
表C.1(续）
回收率/%
重复性/%
定性限/
(μg/mL)
YC/T282—2009
定量限/
(μg/mL)
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。