本标准规定了动物结核病的检测方法和要求。本标准适用于动物结核病检测。

GB/T 18645—2002
本标准主要是根据世界动物卫生组织[WorldOrganization forAnimalHealth（英），Office Inten-tionaldesEpizootic（法），OIE1996年颁布的《诊断试验和疫苗标准手册》（Manual of standards for diagnostic tests&.vaccines）中3.2.3、3.2.3.b的牛结核病和3.6.8的禽结核病部分的内容制定的。考虑到我国的实际情况，对其中一些在我国还无法进行的检验技术作了删减（如：淋巴细胞增生试验；-干扰素试验）。
这样，一方面通过与国际同类要求尽可能一致，以使我国适应国际贸易、技术和经济交流。另一方面，又考虑到我国的实际情况，使得技术方法具有可行性。本标准中的生物制品应符合中华人民共和国《兽用生物制品质量标准》（1992)的要求本标准的附录A、附录B、附录C都是标准的附录,附录D是提示的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所。本标准主要起草人：毛开荣、陈向经、关孚时、罗玉峰177
中华人民共和国国家标准
动物结核病诊断技术
Diagnostic techniques for tuberculosis of animal本标准规定「动物结核病的检测方法和要求。本标准适用于动物结核病检测。2定义、符号和缩略语
本标准采用下列符号和缩略语：PP)：提纯蛋衍生物(purified protein derivative)。IU:国际单位(international unit)。3细菌学检查
3.1病料的采集和处理
GB/T 186452002
用于细菌学检查的材料采自淋巴结及其他组织。当活畜有订疑的呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖道结核、肠结核时，其痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便可作为细菌学检查的材料。对那些结核分枝杆菌PPI）皮内变态反应试验阳性，门检时无病理学病变的动物，可从下颌、后、支气管、肺（特别是肺门及肺门淋巴结)、纵膈及一些肠系膜的淋巴结采集样品送检。样品应封装在无菌的容器内冷藏运送为了提高检出结巢，样品可采取消化浓缩法处理，处理方法见附录A（标准的附录）。3.1.1痰
对牛常可用痰进行细菌学检验。牛咯痰极少，宜在清晨采集。用硬橡胶管自口腔伸入至气管内，外端连接注射器吸取痰液。亦可取牛咳出的痰块进行检验。痰样品稀薄时，可加人等量的4%～6%硫酸（见附录A中A1）处理，如痰样品粘稠时，则加入5倍量的1%硫酸处理，充分播匀后置37C作用20min，以3000r/min～4000/min离心，沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。
也可用2倍量15%~20%安替福民（antiformin）溶液（见附录A中A3)处理痰液，将混合物置37C作用1l～2h后离心。以灭菌生理盐水冲洗沉淀物几次后，取沉淀物染色镜检、培养和动物试验。3.1.2乳
怀疑有乳房结核时，可尤菌采集乳汁进行检验（·一般以挤出之最后乳汁含菌量较多，早晨挤出的乳中含菌量最高），
将乳汁分臂 4～6支离心管中，每管10 ml，以3000 r/min～4000 r/min离心20min～30min，吸取层乳脂和管底的沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。乳汁10ml加酒精和乙醚各10mL及15%～20%安替福民溶液30mL，摇匀置37（恒温箱内1h2h，取出加等量灭菌蒸馏水混匀、离心沉淀后弃去上清，取沉淀物作染色镜检、培养和动物试验。3.1.3精液和子宫分泌物
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准178
2002.05-01实施
GB/T 18645--2002
有生殖道结核可疑时，可采集公畜精液、母畜子宫分泌物进行细菌学检查。处理子宫分泌物，可用15%～20%安替福民溶液，混匀后静置2h～3h：3000r/min~4000r/mim离心20min，弃上清，加10ml.蒸馏水于沉淀物中。即可作动物试验，经1.5～2个月剖检。3.1.4尿
有肾结核可疑时，可采集尿液，一般采集中段尿液，以早晨第-一次尿为宜。如仅作染色镜检，可将尿液以3000r/min～4000r/min离心20min后，取沉淀物涂片，如作培养或动物试验，则应将尿液进行消化浓缩处理，再进行检验以免杂菌生长而影响检验结果。3.1.5粪便
有肠结核可疑时，可采集粪便进行细菌学检查，患肺结核的牛只，有时在粪便中亦可检出结核分枝杆菌。因牛常将痰液吞咽至消化道内，随粪便排出。尽量采集混有粘液或脓血的粪便。取粪便30g，加15%~20%安替福民溶液15ml和蒸馏水55ml，混合，经2h～3h后，3000r/min～4000r/min离心30min，倾去上清液，加10mL蒸馏水于沉淀物中，将此液用纱布过滤后接种于豚鼠皮下，经1.5～2个月后剖检或将粪便加2倍量灭菌蒸馏水磨碎，然后加氯化钠至饱和。当液体中残渣沉淀后（液体死全澄清）浮起的薄膜含有大量的结核分枝杆菌。取出薄膜，用等量的4%氢氧化钠（见附录A中A2）充分混合，置37C中3h，然后离心，取沉淀物用8%盐酸中和后，即可作染色镜检、培养和动物试验。粪便中如有粘液或脓血，可挑取粘液脓血选用任何一种消化液处理后检验。如系纯粪便，取5g～10g，加生理盐水约3～4倍混合后，用细铜纱网过滤，取滤液置室温中自然沉淀，然居取上层悬液置于另一大离心管或烧杯内，加消化液约3~4倍量·置37（温箱1h2h，间上法处理后检验。
3.1.6组织器管
尽量采集有结节病灶的部位。猪易患颈部淋巴结结核，亦易患肠系膜淋巴结核，且常星钙化或干酪样病变。家禽常在肠、脾、肝发生结核病灶，有时亦可见于肺或卵巢。病变组织需先研磨，制成乳剂，通常取组织乳剂或其他液状病料2ml~4ml，加人等量的5%氢氧化钠溶液，充分振摇5min～10min，或摇至发生液化为止，液化后经3000r/min~4000r/min离心15min~~30min，沉淀物加1滴酚红作指示剂，以2mol/L盐酸中和至淡红色后，作染色镜检、培养和动物试验。
如病料为脓状或干酪状或钙化的结节病灶组织，可直接作染色镜检·往往可以检出众多的结核分枝杆菌。但得到阴性结果时，应浓缩处理后检验。3.2检验方法
3.2.1染色镜检
3.2.1.1涂片
先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白（鸡蛋白20ml，甘油20ml，水杨酸钠0.4g混勾），然后吸取标本滴加其上，涂布均匀。
如检验标本为乳汁等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，可先用二甲苯或乙醚滴加覆盖于涂片之上，经摇动1min～2min脱脂后倾去，再滴加95%酒精以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。3.2.1.2染色
染色液配制方法见附录B(标准的附录）。妻·尼氏抗酸染色：处理过的被检材料涂片后，经火焰固定，加苯酚复红染色液（见附录B中B1)覆盖，将玻片在火焰上加热至出现蒸汽（不能产生气泡），如此热染5min（如染色液十，须加适量补充）。水洗后滴加3%盐酸酒精（见附录B中B2)脱色30s~60s（至无色素脱下为止:）。水洗后，以骆氏美蔬染色液（见附录B中B3)复染1min。水洗，吸于，镜检。抗酸菌应不被盐酸酒精脱色而染成红色，其他细菌与动物细胞可被盐酸酒精脱色而均被染成蓝色。179
3.2.1.3镜检
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结核分枝杆菌在显微镜下呈细长平直或微弯曲的杆菌，长1.5μm～5μm宽0.2um～0.5μm，在陈I日培养基上或干酪性淋巴结内的菌体，偶尔可见长达10μm或更长。3.2.2珺养
3.2.2.1培养基配制方法见附录C（标准的附录）。3.2.2.2被检标本经消化浓缩后吸取其沉淀物作为培养材料。初次分离，可用配氏培养基（见附录C中C1)L-J培养基(见附录C中C2)或青霉素血液琼脂培养基(见附录C中 C3)。3.2.2.3将经过处理的标本接种到培养基上（同时作2～4份），培养--天后，以熔化的石蜡封口，继续培养。
3.2.2.4牛型结核分枝杆菌比人型结核分枝杆菌生长要缓慢得多。初次培养牛型结核分枝杆菌时，需36C～37（培养5～8周方可出现菌落。在固定培养基上不产生任何颜色，菌落湿润、略显粗糙并发脆。、加1%的丙酮酸钠能促进生长，但在吩-2酸肼（TH)培养基（见附录C中C4)上不生长。3.2.2.5禽型结核分枝杆菌生长需要2～3周。形成湿润、弥漫状，光滑及星光状菌落。最适生长温度为40℃～42C。在TH培养基上生长。3.2.2.6人型结核分枝杆菌生长需要36℃37C培养3～4周。该菌落干燥、粗糙，呈白色、黄色或橙色。牛牢附着于培养基。在T,H培养基上生长。3.2.2.7作典型分枝杆菌生长快速，大部分（但不是全部）产生白色或具有橙色或黄色色索，常形成黄色或橙色菌落。某些种类的色素只有在亮处才显出。大多数非典型种类的生长速度比牛或人型结核分枝杆菌块。
3.2.3动物试验
本试验是确诊结核病的重要依据，如能与涂片镜检和培养同时进行，则结果更为可靠。3.2.3.1试验动物在试验前，应进行牛型结核分枝杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验。
3.2.3.2豚鼠对牛型和人型结核分枝杆菌敏感，对禽型结核分枝杆菌有抵抗力，常只能形成局部病灶。3.2.3.3家免对禽型结核分枝杆菌高度敏感。对牛型结核分枝杆菌敏感。人型结核分枝杆菌虽可使其肺部形成少量病灶，但订趋于痊愈而不致死。3.2.3.4处理过的病料约1ml,～3ml.,皮下或肌肉或腹腔内注射，每份病料至少接种2只同种动物。接种后30d左有，进行禽型结核分枝杆菌PPD和牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验，如有阳性反应，可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。如果为阴性反应，可于40d左右检其中的半数，观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检，另一半继续观察至3个月再剖检观察。
3.2.4牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定方法见附录D(提示的附录）。4结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验4.1牛型结核分枝杆菌PPI)皮内变态反应试验用结核分枝杆菌PPI>进行的皮内变态反应试验对检查活畜结核病是很有用的。该试验用牛型结核分枝杆菌PPD进行。
4.1.1牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验山生后20d的牛即可用本试验进行检疫。4.1.1.1操作方法
a）注射部位及术前处理：将牛只编号后在颈侧中部上三分之处剪毛（或提前天剃毛），三个月以内的犊牛，也可在肩脚部进行，直径约10cm。用卡尺测量术部中央皮皱厚度，作好记录。注意，术部应无明显的病变。
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b）注射剂量：不论大小牛只，一律皮内注射0.1mL（含2000IU）。即将牛型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫升含2万IU后，皮内注射0.1mL。冻干PPD稀释后当天用完。c）注射方法：先以75%酒精消毒术部，然后皮内注射定量的牛型结核分枝杆菌PPI)，注射后局部应出现小疱，如对注射有疑问时，应另选15cm以外的部位或对侧重作。d）注射次数和观察反应：皮内注射后经72h判定，仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎反应，并以卡尺测量皮皱厚度，作好详细记录。对疑似反应牛应立即在另侧以同--批PPD同剂量进行第二回皮内注射，再经72h观察反应结果。对阴性牛和疑似反应牛，于注射后96h和120h再分别观察次，以防个别牛出现较晚的迟发型变态反应。
4.1.1.2结果判定Www.vV99.net
a）阳性反应：局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0mm。b）疑似反应：局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0mm、小于4.0mm。c）阴性反应：无炎性反应。皮厚差在2.0mm以下。凡判定为疑似反应的牛只，于第一次检疫60d后进行复检，其结果仍为疑似反应时，经60d再复检，如仍为疑似反应，应判为阳性。4.1.2其他动物牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验参照牛的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验进行。4.2禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验是最广泛使用于家禽的试验。牛及其他哺乳动物也可用牛型结核分枝杆菌PPD和禽型结核分枝杆菌PPD同时在不同的部位进行，以区分特异性和非特异性变态反应。
4.2.1禽的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验4.2.1.1操作方法
用10mm×0.5mm针头肉垂皮内注射0.1mL（0.25万IU）禽型结核分枝杆菌PPD,48h后观察结果。
4.2.1.2结果判定
阳性反应为接种部位肿胀，从5.0mm直径的小硬结到扩展至其他肉垂与颈部的广泛性水肿。火鸡肉垂的结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验，没有家禽的试验那样可靠。其他禽类也可用翼蹼作试验，但结果一般不理想。水禽可接种脚蹼，但试验不敏感并经常与接种部位的感染相混淆。4.2.2牛的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验4.2.2.1操作方法
与牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验相同，只是禽型结核分枝杆菌PPD的剂量为每头0.1mL，含0.25万IU。即将禽型结核分枝杆菌PPD稀释成每毫升含2.5万IU后，皮内注射0.1ml.。4.2.2.2结果判定
a）对牛型结核分枝杆菌PPD的反应为阳性（局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.（mm），并且对牛型结核分枝杆菌PPD的反应大于对禽型结核分枝杆菌PPI）的反应，二者皮差在2.0mm以.上，判为牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。对已经定性为牛型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0mm以下，甚至对牛型结核分枝杆菌PPD的反应略小于对禽型结核分枝杆菌PPD的反应（反应差小于或等于2.0mm），只要对牛型结核分枝杆菌PPD的反应在2.0mm以上，也应判定为牛型结核分枝杆菌PPI)皮内变态反应试验阳性牛。
b）对禽型结核分枝杆菌PPD的反应大于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应，两者的皮差在2.0mm以上，判为禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性。181
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对己经定性为副结核分枝杆菌或禽型结核分枝杆菌感染的牛群。其中即使少数牛的皮差在2.0mm以下，甚至对禽型结核分枝杆菌PPD的反应略小于对牛型结核分枝杆菌PPD的反应（不超过2.0mm），只要对禽型结核分枝杆菌PPD的反应在2.0mm以上，也应判为禽型结核分枝杆菌PPID皮内变态反应试验阳性牛
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附录A
（标准的附录）
标本消化浓缩法
痰液或乳汁等样品，由于含菌量较少，如直接涂片镜检往往是阴性结果。此外，在培养或作动物试验时，常因污染杂菌生长较快，使病原结核分枝杆菌被抑制。下列儿种消化浓缩方法可使检验标本中蛋白质溶解、杀火污染杂菌，而结核分枝杆菌因有蜡质外膜而不死亡，并得到浓缩。A1硫酸消化法
用4%～6%硫酸溶液将痰、尿、粪或病灶组织等按1：5之比例加人混合，然唇置37（作用1h~2h，经3000r/min4000r/min离心30min，弃上清，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。也i用硫酸消化浓缩后·在沉淀物中加人3%氢氧化钠中和，然后抹片镜检、培养和接种动物。A2氢氧化钠消化法
取氢氧化钠35g~40g，钾明矾2g，溴麝香草酚蓝20mg（预先用60%酒精配制成0.1%浓度，应用按比例加人），蒸馏水1000mL混合，即为氢氧化钠消化液。将被检的痰、尿、粪便或病灶组织按1：5的比例加入氢氧化钠消化液中，混勾后，37（作用2h～3h，然后无菌滴加5%～10%盐酸溶液进行中和，使标本的pH调到6.8左右（此时显淡黄绿色），以3000r/min～4000r/min离心15min~20min，弃上清，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。在病料中加人等量的4%氢氧化钠溶液，充分摇荡5min～10min，然后用3000r/min离心15min～20min，弃上清，加1滴酚红指示剂于沉淀物中，用2mol/L盐酸中和至淡红色，然后取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。
在痰液或小脓块中加人等量的1%氢氧化钠溶液，充分振摇15min，然后用3000r/min离心30min，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。对炭液的消化浓缩也可采用以下较温和的处理方法：取1mol/L（或1%)氢氧化钠水溶液50mL0.1moi/lL.柠檬酸钠50ml,N-乙酰-L-半胱氨酸0.5g，混合。取痰一份，加上述溶液2份，作用24h～48h，以3000r/min离心15min，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。A3安替福民（antiformin）沉淀浓缩法溶液A：碳酸钠12g、漂白粉8g、蒸馏水80ml。溶液B：氢氧化钠15g、蒸馏水85mL。应用时A、13两液等量混含，再用蒸馏水稀释成15%~~20%后使用，该溶液须存放于棕色瓶内。将被检样品置于试管中，加人3~～4倍量的15%～20%安替福民溶液，充分摇匀后37作用1h，加1～2倍量的火菌蒸馏水，摇匀，3000r/min～4000r/min离心20min~～30min，弃上清沉凝物加蒸馏水恢复原量后再离心一次，取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物。附录B
（标准的附录）
薰-尼氏抗酸染色液配制方法
B1苯酚复红染色液
碱性复红饱和酒精溶液（每100mL95%酒精加3g碱性复红）10ml，5%苯酚溶液9ml，者混183
合后用滤纸滤过。
B23%盐酸酒精脱色液
GB/T 18645—2002
浓盐酸3ml，95%酒精97ml，混勾。B3骆氏美蓝染色液
甲液：美蓝0.3g，95%酒精30ml
乙液：0.01%氢氧化钾溶液100ml。将坤乙两液相混合。
附录C
（标准的附录）
培养基配制方法
C1 配氏(Petragnane)培养基
C1.1成分
新鲜脱脂牛奶450ml，马铃薯淀粉18g，天门冬素（或蛋白陈）2.6g，去皮马铃薯225g，鸡蛋15个（除去3个蛋清），甘油40g，2%孔雀绿水溶液30ml。C1.2制法　
将马铃薯去皮擦成丝，加入马铃薯淀粉、天门冬素（或蛋白陈）、脱脂牛奶置烧杯中水浴煮沸40min~60min，并不时搅拌均勾，使成糊状。待冷却至50℃时加人打碎的鸡蛋（蛋壳先用75%酒精消静洗净），混匀后用四层纱布过滤除渣。最后加入甘油和孔雀绿水溶液搅拌均勾，分装于灭菌的试管中。将分装培养基的试管置血清凝固器（或流通蒸汽锅）内，间歇灭菌3次，每天一次，第一天65C灭菌30min，第二、天75℃80C灭菌30min。C1.3用途
分离培养结核分枝杆菌用。
C2 L-J(Lowenstein-Jensen)培养基C2.1成分
无水磷酸二氢钾（KHzPO.)2.4g.硫酸镁（MgSO·H2O)0.24g，枸橼酸镁0.6g，DL-天门冬素（I)I.Asparagin）3.6g，甘油12g，蒸馏水600ml，马铃薯粉30g，鸡蛋（约30个）1000ml，2%孔雀绿水溶液20ml。
C2.2制法
将磷酸二氢钾、硫酸镁、枸檬酸镁、甘油和蒸馏水混合，加热使溶解。取马铃薯粉加入上述溶液内，随加随搅拌，水浴煮沸1h。鸡蛋用75%酒精消毒外壳后，打开，将蛋清和蛋黄充分搅勾，4层纱布过滤。待上述加马铃薯粉的盐溶液冷却至50'C时，加人鸡蛋液和孔雀绿，并充分搅勾。分装.80（灭菌30min后，37C培养48h，若无杂菌污染即可使用。C2.3用途
供培养结核分枝杆菌用。
C3青霉素血液琼脂培养基
C3.1成分
GB/T 18645--2002
琼脂1.5g，中性甘油1mL，蒸馏水74mL，兔全血（或牛全血）25ml，青霉素（2000IU/mL）1.85 ml。
C3.2制法
将琼脂、中性甘油及蒸馏水混合，经103.4kPa15min灭菌。待冷却到50℃时加人兔全血（或牛全血）与青霉素，混合后分装，经37℃培养48h，无杂菌污染即可使用。C3.3用途
供培养结核分枝杆菌用。
C4噻吩-2酸(T,H)培养基
C4.1成分
L-J培养基,T,H。
C4.2制法
取L-J培养基（见C2)100mL，水浴煮沸，加T,H1mg，充分搅匀。分装；80℃灭菌30min后，37C培养48h，若无杂菌污染即可使用。C4.3用途
供结核分枝杆菌生化鉴定用。
附录D
（提示的附录）
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌鉴定牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的鉴定，主要依据生化试验和动物试验。D1
生化试验
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的生化试验特性见表D1。表D1
生化试验类型
牛型结核分枝杆菌
禽型结核分枝杆菌
人型结核分枝杆菌
D1.1烟酸试验
烟酸试验
Tween-80
水解试验
耐热接触酶试验硝酸盐还原试验+
尿素酶试验
T,H抗性试验
D1.1.1试验方法
以热蒸馏水浸泡固体培养基上的培养物15min～30min，洗下。每个培养物分装人2支试管中，每管0.4ml，再加人3%联苯胺乙醇溶液0.2mL。然后向其中-管加入10%溴化氰溶液（此液剧毒，应在通风橱内操作)0.2mL。
D1.1.2结果判定
凡含10%溴化氰溶液的试管出现桃红色沉淀，另一管只产生无色沉淀者判为阳性；两支试管都为产生无色沉淀者判为阴性。
D1.2吐温-80(Tween-80)水解试验D1.2.1试验方法
GB/T 18645—2002
向100ml.磷酸缓冲液（1/15mol/L，pH7.0)中加人0.5ml,Twecn-80、2ml0.2%中性红溶液。经112kPa灭菌20min，分装于试管中，每管2mL。在4℃～10C可保存2周。取上述试管，加人10mg/mL的菌液0.5ml.,37℃培养，3d-5d观察结果。D1.2.2结果判定
试管内由原来的琥珀色变为桃红色或红色者判为阳性。无颜色变化为阴性。D1.3耐热接触酶试验
D1.3.1试验方法
用生理盐水配制出5mg/mL~10mg/mL的菌液，分装试管，每管0.5mL，以68C水浴20min，冷却后加人0.5mL过氧化氢（H,O,）和Tween-80混合液（10%Tween-80加等量30%H2O2）。观察结果。D1.3.2结果判断
肉眼观察，如有多量小气泡自管底升起，即为阳性。否则为阴性。D1.4硝酸盐还原试验
D1.4.1试验方法
在100mLpH7.0的磷酸盐缓冲液中，加人硝酸钠（NaNO：H,O)85mg，经112kPa灭菌20min后分装，每管2ml。
向上述溶液中加人10mg/mL的菌液，经37C水浴2h后，加人1滴2倍稀释的盐酸，2滴0.2%氨苯磺胺，2滴0.1%N-甲基盐酸二氨基乙烯。在4C～10C存放2周后判断结果。D1.4.2结果判定
呈粉红色至紫红色者为阳性。无色或淡粉色为阴性。D1.5尿素酶试验
D1.5.1试验方法
将被检材料接种尿素培养基。37C培养。D1.5.2结果判定
在尿素培养基上长出结核分枝杆菌菌苔（或菌落）,并且使培养基变成红色，即为阳性。培养基不变色为阴性。
D1.6 T,H抗性试验
D1.6.1试验方法
将被检材料接种T,H培养基和L-J培养基。37C培养。D1.6.2结果判定
在上述两种培养基上长出结核分枝杆菌菌苔（或菌落)即为阳性。若在L-J培养基上生长，而在T,H培养基上不生长，则为阴性。
D2动物试验
牛型、禽型和人型结核分枝杆菌的动物试验特性见表D2。表D2
试验动物
牛型结核分枝杆菌
禽型结核分枝杆菌
人型结核分枝杆菌
不易感
不易感
不易感
不易感
D2.1试验方法
GB/T 18645-2002
试验动物在试验前，应进行结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验。豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测；鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测；免用牛型和禽型结核分枝杆菌PPD检测。将处理过的病料约1mL～3ml，选用皮下、肌肉或腹腔内途径注射试验动物，每份病料至少接种2只同种试验动物。
接种后30d左右，对豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测；对鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测；对兔用牛型结核和禽型结核分枝杆菌PPD检测。如有阳性反应，可剖检其中的半数动物进行病理学观察、细菌培养和涂片镜检。另一半继续观察至3个月再剖检观察。如果为阴性反应，可于40d左右剖检其中的半数，观察病理学变化、细菌培养和涂片镜检，另一半继续观察至3个月再剖检观察。D2.2结果判定
D2.2.1牛型结核分枝杆菌感染
鸡用禽型结核分枝杆菌PPD检测阴性，无任何病变，细菌培养和涂片镜检都未见到结核分枝杆菌。同时从豚鼠和兔检测到结核分枝杆菌。或豚鼠和兔的牛型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。
D2.2.2禽型结核分枝杆菌感染
豚鼠用牛型结核分枝杆菌PPD检测阴性，无任何病变，细菌培养和涂片镜检都未见到结核分枝杆菌。同时，从兔和鸡检测到结核分枝杆菌。或兔或鸡的禽型结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。
D2.2.3人型结核分枝杆菌感染
仅从豚鼠检测到结核分枝杆菌。或仅豚鼠的牛结核分枝杆菌PPD皮内变态反应试验阳性并观察到典型病理变化。
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