ICS65.020.01
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1433-2007
DNA指纹方法
水稻品种鉴定
Identification of Rice (Oryza sativa L.) Varieties Using Microsatellite Markers2007-09-14发布
2007-12-01实施
中华人民共和国农业部
本标准的附录A为规范性附录，附录B、C为资料性附录。NY/T1433—-2007
本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：中国水稻研究所、农业部科技发展中心、农业部稻米及制品质量监督检验测试中本标准主要起草人：庄杰云、施勇烽、吕波、陈能、杨坤、应杰政、曾瑞珍。1范围
水稻品种鉴定
DNA指纹方法
NY/T1433—2007
本标准规定了水稻（OryzasativaL.）品种DNA指纹鉴定的实验方法及判定标准。本标准适用于水稻品种差异性鉴定。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB4404.1粮食作物种子禾谷类
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
通过化学方法使水稻DNA从样品的不同成分中分离出来，弃除样品中的蛋白质、脂肪、多糖及其他次生代谢物，以及样品中加人的三氯甲烷、异戊醇、乙醇等试剂，获得纯化的DNA，作为PCR反应的模板。对模板进行PCR扩增，得到的PCR产物在电泳过程中的电荷效应作用下得到良好的分离，通过显色显示水稻DNA谱带类型。不同品种由于遗传组成不同，引物DNA序列存在差异或引物结合部位之间的DNA片段大小存在差异，这种差异可利用电泳图谱加以鉴别，从而对品种差异性进行鉴定。4试剂与材料
除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，所用水符合GB/T6682中规定的三级以上水的要求。相关溶液配制方法见附录A1。
4.1甲醛。
4.2N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)。4.3DNA分子量标记。
4.4石蜡油。
4.5TaqDNA聚合酶(2Unit/μL)。4.6无水乙醇。
4.710mol/L氢氧化钠溶液。
4.810%TWEEN-20溶液（V/V)。
4.90.5mol/LEDTA溶液。
4.10 1 mol/L Tris-HCI 溶液。4.115mol/L氯化钠溶液。
4.12DNA提取液。
4.13三氯甲烷萃取液。
4.141×TE缓冲液。
4.152.5mmol/LdNTP溶液。
NY/T1433--2007
4.161mol/L硫酸氨溶液。
4.175×PCR反应缓冲液。
4.1825mmol/L氯化镁溶液。
4.19引物溶液，推荐使用的引物及其序列参见附录C。4.2070%乙醇溶液（V/V)。
4.215×TBE缓冲液。
4.221×TBE缓冲液。
4.23100g/L过硫酸铵溶液。
4.24400g/L丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺混合液。4.2510g/L琼脂糖溶液。
4.26氢氧化钠显色溶液。
4.270.5g/L硝酸银溶液。
4.286×溴酚蓝-二甲苯青电泳指示剂。5仪器
见附录A2。
6分析步骤
6.1试验样品
试验样品为水稻种子，其质量应符合国家标准GB4404.1中对水稻种子纯度的要求。同时检测待鉴定品种和对照品种，每个品种分别检测5个个体，对一致性差的品种可增加检测的个体数，同一批品种的各个体按下述步骤同步进行。6.2DNA提取
从幼苗或植株上取水稻叶片2cm～3cm放人研钵中，加入DNA提取液400μL，研碎，再加人DNA提取液400μL；移取500μL混合液至1.5mL微量离心管，加入500uL三氯甲烷萃取液，轻缓颠倒混。经12000r/min离心30s至分相，取上清液400uL，转入新的1.5mL管中。加人800μL冰乙醇，轻缓颠倒混匀，经12000r/min离心3min至分相，弃上清液。再用70%乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥后，加人50μuL1×TE缓冲液溶解沉淀，置于-20℃保存备用。6.3PCR扩增
6.3.1引物
推荐使用的24对基本核心引物及其序列参见附录C。优先使用其中的12对引物（推荐类型为I），完成后若未获得确定结果，再增加其他12对引物（推荐类型为Ⅱ），如果必要可增加指定的辅助引物。
6.3.2标准PCR反应液的配制及扩增准备在200μL的PCR反应管中依次加人2L5×PCR反应缓冲液、0.8uLdNTP溶液和0.6μL氯化镁溶液，正、反向引物溶液各1μL、经6.2提取备用的模板DNA1uL、0.25uLTagDNA聚合酶，加人灭菌蒸馏水3.25μL，使PCR反应体积达到10uL。再加约20μuL的石蜡油（有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油）。PCR反应体系除可自行配置外，也可采用试剂盒。6.3.3扩增反应
将PCR管放人PCR扩增仪中，在预设的扩增条件下反应。94℃下预变性2min；进行30次扩增反应循环（94℃下变性45s，55℃下退火45s，72℃下延伸1min）；然后72℃下延伸8min；最后10℃恒温冷2
却。取出PCR反应管，对扩增产物进行电泳检测。6.4PCR扩增产物的检测
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本标准PCR扩增产物的检测采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，但有条件的单位可采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、测序等检测方法。6.4.1非变性聚丙烯酰胺凝胶制备在一对玻璃板间插入1.0mm宽的间隔片，将玻璃板对齐夹紧，在封口处注入琼脂糖溶液，让其在10min~15min凝固密封。然后，在烧杯中循序加入5mL5×TBE缓冲液、3.75mL丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺混合液，搅拌并用灭菌水定容至25mL；加入200uL过硫酸铵和12μLTEMED，混匀后倒人凝胶板之间，随即插好样品梳，使其在50min～60min内聚合凝固，凝胶高度应不小于10cm。6.4.2PCR扩增产物电泳分离
小心抽出样品梳，去掉封口的琼脂糖胶，将玻璃板固定于垂直电泳槽上，在电泳槽中加入1×TBE缓冲液。在每份扩增产物中加人2uL6×溴酚蓝-二甲苯青电泳指示剂，然后用微量进样器吸取1.5uL扩增产物与指示剂的混合液加人样品孔中；同时，根据样品数量，加样适量的DNA分子量标记，一般在待测样品两侧的样品孔中加入分子量标记。开始电泳，选用的电压梯度为1V/cm～5V/cm，一般电泳300VH～600VH，具体时间可根据待测片段的预计长度、按二甲苯青迁移的时间来推算。6.4.3银染显色
电泳完毕后关闭电源，取下玻璃板。小心分开两块玻璃板，取下聚丙烯酰胺凝胶，双蒸水冲洗30s60s，放人装有400mL硝酸银的塑料盆中，轻摇（50r/min）5min~10min进行染色；同时，量取400mL氢氧化钠显色溶液，加人1.6mL甲醛。将染色盆中的硝酸银倒出，用双蒸水冲洗凝胶两遍，每遍30s～60s；加人新配制好的显色液，显色至条带清晰出现，倒出显色液，用蒸馏水冲洗两遍，沥干。6.4.4凝胶成像及带型分析
扫描成像及其保存。先用12对引物（推荐类型I）检测，如未有2对以上（含2对）的引物检测到差异，再用备用的12对引物（推荐类型Ⅱ）检测。7结果分析和表述
7.1基本结果表述
检测的总体情况和各引物的检测结果按附录B进行汇总。7.2结论
以多数个体具有的谱带即主带作为品种的特征谱带进行分析：a）检测到品种间差异的引物对≥2,判定为“不同品种\；b）检测到品种间差异的引物对=1,判定为“近似品种”；c）检测到品种间差异的引物对=0,判定为“相同品种或极近似品种”。若检测到品种间差异的引物对≤1，必要时可增加其他方法佐证。3
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A.1溶液配制
附录A
（规范性附录）
溶液配制及仪器
A.1.110mol/L氢氧化钠溶液：称取80g氢氧化钠，加水溶解并定容至200mL。A.1.210%TWEEN-20溶液（V/V)：移取1mLTWEEN-20，加水定容至10mL。A.1.30.5mol/LEDTA溶液：称取186.1g乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2*2HO)，加人800mL水中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，用氢氧化钠调节pH至8.0，加水定容至1000mL，在103.4kPa灭菌20mina
A.1.41mol/LTris-HCl溶液：称取121.1g三羧甲基氨基甲烷(Tris），加人800mL水中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，用浓盐酸调节pH至8.0,加水定容至1000mL，在103.4kPa灭菌20min。A.1.55mol/L氯化钠溶液：称292.2g取氯化钠，加入750mL水中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，加水定容至1000mL，在103.4kPa灭菌20min。A.1.6DNA提取液：称取15g十二烷基磺酸钠（C/2H2sOS4Na），加人100mLTris-HCI溶液（A.1.4），40mLEDTA溶液（A.1.3）和100mL氯化钠溶液（A.1.5），在磁力搅拌器上搅拌溶解，加双蒸水定容至1000mL
A.1.7三氯甲烷萃取液：三氯甲烷、无水乙醇和异戊醇按76+20+4的体积混合。A.1.81×TE缓冲液：移取10mLTris-HCI溶液（A.1.4）和2mLEDTA溶液（A.1.3），加水定容至1000mL，在103.4kPa灭菌20min。A.1.92.5mmol/LdNTP溶液：各10mmol/L的四种脱氧核苷三磷酸（dATPdCTP，dGTP，dTTP）等量混合溶液。
A.1.101mol/L硫酸氨溶液：称取13.2g硫酸氨，加水溶解并定容至100mL。A.1.115×PCR反应缓冲液：量取335mLTris-HCl溶液（A.1.4）、80mL硫酸氨溶液（A.1.10）和5mLTWEEN-20溶液，用水定容至1000mL，在103.4kPa灭菌20min。A.1.1225mmol/L氯化镁溶液：称取2.03g结晶氯化镁（MgCl2-6H2O），加人100mL水中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，定容至400mL，在103.4kPa灭菌20min。A.1.13引物溶液：每10D约含33μg引物，加人1mL灭菌水稀释为约5μumol/L。推荐使用的引物及其序列参见附录C。
A.1.1470%乙醇溶液（V/V）：取无水乙醇700mL，加水定容至1000mL。A.1.155×TBE缓冲液：称取54g三羧甲基氨基甲烷（Tris）、27.5g硼酸（H,BOs），加人20mLEDTA溶液（A.1.3），加入800mL水中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，加水定容至1000mL，在103.4kPa灭菌20min
A.1.161×TBE缓冲液：量取200mL5×TBE缓冲液，加水定容至1000mL。A.1.17100g/L过硫酸铵溶液：称取1.0g过硫酸铵，加水溶解并定容至10mL，4℃下保存。使用有效期为1~2周。
A.1.18400g/L丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺混合液：称取38.0g丙烯酰胺（CHsNO)和2.0g甲叉双4
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丙烯酰胺（C,H1oN2O2），加水溶解并定容至100mL，装人棕色瓶，4℃下保存。使用有效期为3～4周。注：丙烯酰胺有神经毒性，配制和使用时要戴一次性手套。A.1.1910g/L琼脂糖溶液：称取2.0g琼脂糖，加人200mL1×TBE缓冲液（A.1.16)中，加热溶解，待冷却至55℃左右使用。
A.1.20氢氧化钠显色溶液：称取6.0g氢氧化钠、0.076g四硼酸钠（NazB4O·10H2O)，加水定容至400mL。
A.1.210.5g/L硝酸银溶液：称取0.5g硝酸银，加水溶解并定容至1000mL，贮存于棕色瓶中。A.1.226×溴酚蓝-二甲苯青电泳指示剂：分别称取0.25g溴酚蓝、0.25g二甲苯青、40g蔗糖，加人70mL水中，在磁力搅拌器上搅拌溶解，并用水定容至100mL，4℃下保存。A.2仪器
A.2.1通用实验室仪器设备。
A.2.2高速台式离心机（12000r/min）。A.2.3摇床。
A.2.4PCR扩增仪。
A.2.5微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL)。A.2.6微量离心管。
A.2.7200μLPCR管。
磁力搅拌器。
高压灭菌锅。
A.2.10垂直电泳槽。
电泳仪。
A.2.12扫描仪。
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未检测到品种内变异
检测到品种内变异
引物名称
附录B
（资料性附录）
检测结果汇总表和各标记的检测结果汇总表表1检测结果汇总
应用的引物数
2各引物的检测结果
品种内变异
待测品种与对照品种的差异性
检测到差异
检测到品种间差异的引物数
未检测到差异
注：按“无品种内变异”和\有品种内变异”两种类型依次记录各对引物。“无品种内变异”指对照品种和待测品种的5个样品分别检测到一致的谱带；“有品种内变异”指对照品种或待测品种存在样品间的谱带差异，需要注明对照品种和待测品种均存在品种内变异或仅哪一个存在品种内变异。6
RM5414
RM1195
附录C
（资料性附录）
推荐的24个SSR标记的水稽基因组分布及其引物序列物理位置
32093949
8761504
36287160
2021760
26661876
1764638
21818658
6757363
7887585
9347372
17767906
2432080
6153085
35160202
9734810
23825125
2849973
5437340
25651810
146952
19320020
17570591
26796502
26949995
正向引物序列（5°-3）
TCTTTGGAGGCGAGCTGAG
CTAGAGGCGAAAACGAGATG
CCAAAGATGAAACCTGGATTG
ACCATGGTTCAAGAGTGAAA
CCTCGCTTATGAGAGCTTCG
CTTTGTCTATCTCAAGACAC
CTTACAGAGAAACGGCATCG
CCGGCGATAAAACAATGAG
CGTCGGATGATGTAAAGCCT
TGGTAGTATAGGTACTAAACAT
ATATGAGTTGCTGTCGTGCG
CAAAAACAGAGCAGATGAC
ATGGACCACAAACGACCIIC
TCTGCAAGCCTTGTCTGATG
CCGGTATOCTTCGATATTGC
GAAGOCGTCGTGAAGTTACC此内容来自唯久标准下载网
TGCAGACATAGAGAAGGAAGTG
TCCTTCAAGAGTGCAAAACC
TTCCCTCTCATGAGCTCCAT
GTAGGAAAGGAAGGGCAGAG
GTAGTGAGCCTAACAATAATC
TGCTGTATGTAGCTOGCACC
ATCGATCGATCTICACGAGG
TGOCCTGTTATTTTCTTCTCTC
所示基因组位置和引物序列来自Gramene数据库（gramene.org）。NY/T1433-—2007
反向引物序列（5°-3）
CGAAGGGTACATCTGCTTAG
GGGTGGGCGAGGTAATAATG
GCACAAGGTGAGCAGTCC
ACAGCTCAACCTGTTGAGTG
CTTCTCCATCACTCCCATGG
TTGCAGATGTTCTICCTGATG
GCTGGTTTGTTTCAGGTTCG
GCATCGGTCCTAACTAAGGG
CATATCGGCATTCGCCTG
TCCTATACACATACAAACATAC
CAACTTGCATCCTCCCCTCC
CTCAAGATGGACGCCAAGA
CGACTCCCTTGTTCTTCTGG
TAAGTCGATCATTGTGTGGACC
CCGACTITTUCTCCTGACG
GTTTCCTACCTGATCGCGAC
AGCAACAGCACAACTIGATG
GCATTGTCATGTCGAAGCC
GAGTGCCTGGCGCTGTAC
CGATAGATAGCTAGATGTGGCC
TCAACTCAGCATCTCTGTOC
TGGCCTTTAAAGCTGTCGC
TGCTATAAAAGGCATTCGGG
GGTGATCCTTTCCCATTTCA
I型标记含推荐为首先采用的12对引物，Ⅱ型标记含推荐为候补使用的12对引物。7
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中华人民共和国
农业行业标准
水稻品种鉴定DNA指纹方法
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中国农业出版社出版
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2007年11月第1版
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2007年11月北京第1次印刷
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