本标准规定了用p-二甲氨基肉桂醛分光光度法测定饲料添加剂d-生物素和预混料(维生素预混料和复合预混料)中d-生物素的方法。本标准适用于饲料添加剂d-生物素、维生素预混料和复合预混料中d-生物素的测定。

GB/T17778—1999
本标准等效采用日本农牧水产畜牧局发布并实施的饲料添加剂规格《d-生物素制剂》中的测定标准第1法。在技术内容上对日本饲料添加剂规格《d-生物素制剂》的测定方法作了部分改动，即添加了标准曲线的绘制。同时，按GB/T6379--1986《测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性》的规定及4个质量控制良好的实验室协同实验的结果，增设了“重复性”。本标准根据“质技监标函【19991178号关于标准GB/T17778—1999复合预混料中d-生物素的测定第-一号修改单的函”进行修改。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准由国家饲料质量监督检验测试中心(武汉)负责起草。本标准主要起草人：钱方、钱沁、杨先奎。23
1范围
中华人民共和国国家标准
预混料中d-生物素的测定
分光光度法
Method for determination of d-biotin in premixSpectrophotometry
GB/T 17778--1999
本标准规定了用p-二甲氨基肉桂醛分光光度法测定饲料添加剂d-生物素和预混料（维生素预混料和复合预混料)中d-生物素的方法。本标准适用于饲料添加剂d-生物素、维生素预混料和复合预混料中d-生物素的测定。2方法原理
将试样中d-生物素用无水乙醇提取出来,在硫酸乙醇溶液中d-生物素和p-二甲氨基肉桂醛生成橙红色化合物，在一定范围内颜色深浅与d-生物素含量成正比。3试剂和溶液
本标准所用试剂，除特殊说明外，均为分析纯。3.1 无水乙醇(GB/T 678-1990)。3.2硫酸无水乙醇溶液（2+98）：量取2mL硫酸和98mL无水乙醇，混勾。3.3p-二甲氨基肉桂醛无水乙醇溶液（2g/L):称取0.2g力-二甲氨基肉桂醛溶于无水乙醇，用无水乙醇稀释至100mL，混匀。
3.4d-生物素标准溶液
3.4.1d-生物素标准储备溶液：准确称取0.1000gd-生物素溶解于无水乙醇，定量转入100mL棕色容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，混匀。此液1.00mL含d-生物素1.00mg。3.4.2d-生物素标准工作溶液：准确量取d-生物素标准储备溶液1.00mL于100mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，混匀。此液1.00mL.含d-生物素10.00μg。4仪器、设备
4.1分光光度计：1.0cm比色，可在530nm处测定吸光度。4.2磨口平底烧瓶200mL。
5试样制备
取具有代表性样品至少2kg，用四分法缩分至250g，粉碎过0.42mm孔筛，混匀，装入样品瓶内密闭，保存备用。
国家质量技术监督局1999-06-14批准2000-02-01实施
6测定步骤
6.1提取
6.1.1预混料中d-生物素的提取
GB/T 17778—1999
称取试样约5g（精确至0.0001g），置于磨口平底烧瓶中，加入30mL无水乙醇，置水浴中煮沸回流45min，冷却至室温后，转移到50mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度。过滤，弃去开始的20mL，余下作为试样提取液。
6.1.2饲料添加剂d-生物素的提取称取试样约1g（精确至0.0001g），置于磨口平底烧瓶中，加入30mL无水乙醇，置水浴中煮沸回流45min，冷却至室温后，转移到100mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度。过滤，弃去开始的20mL，余下作为试样提取液。
6.2测定
6.2.1试样的测定
精确吸取6.1.1试样提取液5.00mL或6.1.2试样提取液2.00mL于25mL容量瓶中，加入硫酸无水乙醇溶液（3.2)1.0mL和p-二甲氨基肉桂醛无水乙醇溶液（3.3)2mL，摇匀，室温下放置1h，用无水乙醇（3.1)稀释至刻度，摇匀；另取无水乙醇代替样液，与试样同时同样处理，作参比液。用1.0cm比色Ⅲ在530nm处，用分光光度计测定吸光度，在标准曲线上查得试样中d-生物素的含量。6.2.2工作曲线的绘制
精确吸取d-生物素标准工作溶液（3.4.2)2.00,5.00，10.00,15.00，20.00mL于25mL容量瓶中，以下步骤按6.2.1中“加入硫酸无水乙醇溶液（3.2)1.0mL.”的操作进行，测定吸光度，绘制标准曲线。
6.3测定结果的计算
6.3.1测定结果按式(1)计算：
式中：X---每干克试样中d-生物素的含量，mg;m标准曲线上查得测定时所取试样提取液中d-生物素的质量，g；V2——试样提取液总体积,mL
mo-试样质量,g,
V试样测定时吸取试样提取液体积，mL。结果表示到小数点后一位。
6.3.2重复性Www.vV99.net
每个试样取两份试料进行平行测定，以其算术平均值为测定结果。测定结果的相对偏差应不大于20%。238
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