本标准等效采用国际标准ISO 6579-1981《饲料中沙门氏菌检验方法》。

中华人民共和国国家标准
饲料中沙门氏菌的检验方法
Method for determination of Salmonellain feeds
本标准等效采用国际标准ISO6579—1981《饲料中沙门氏菌检验方法》。1主题内容与适用范围
本标准规定了饲料中沙门氏菌的测定方法。GB13091--91
本标准适用于配合饲料(包括混合饲料)和动物性单一饲料中沙门氏菌的检验。2引用标准
GB4789.1食品卫生微生物学检验总则3原理
根据沙门氏菌的生理特性，选择有利于沙门氏菌增殖而大多数细菌受到抑制生长的培养基，进行选择性增菌、选择性平板分离，以求检出饲料中的沙门氏菌。4设备和材料
4.1天平：感量1g，最大秤量1000g。4.2显微镜：1500×。
4.3温箱：36±1℃，43±1℃。
4.4冰箱：普通冰箱。
4.5均质器：8000~10000r/min。4.6广口三角瓶：500mL。
4.7三角瓶：250mL。
4.8水浴锅：45±1℃，55±1℃，77±1℃。4.9吸管：1、5、10mL。
平皿：血底直径9cm。
电炉。
酒精灯。
接种棒：镍铬丝。
试管。
载玻片。
试管架。
4.17干燥箱：50~250±1℃。
4.18乳钵。
国家技术监督局1991~07-16批准158
1992-04-01实施
4.19温度计，100℃。
4.20高压灭菌器：2.5kg。
5 培养基和试剂
详见附录A（补充件）。
5.1缓冲蛋白陈水。
5.2四硫磺酸钠煌绿增菌液。
5.3亚硒酸盐胱氨酸增菌液。
5.4酚红煌绿琼脂。
5.5 DHL琼脂。
营养琼脂。
5.7三糖铁琼脂。
5.8尿素琼脂。
赖氨酸脱羧试验培养基。
V-P反应培养基。
肌酸溶液。
α-萘酚乙醇溶液。
氢氧化钾溶液。
靛基质反应培养基。
柯凡克试剂。
β-半乳糖苷酶试剂。
半固体营养琼脂。
盐水溶液。
样品采集
参照GB4789.1的要求执行。
检验程序
沙门氏菌检验程序如下：
GB13091--91
GB 13091-91
检验样品25g+预增菌培养基（缓冲蛋白陈水）225mL，在36±1 培养16~20h
取预增菌培养物10 mL接种于四硫磺酸钠烷绿增菌液中，在43℃培养18~20h
煌绿琼脂（平血）36±1℃培养20~40h，如有需要培养至48 h
取预增菌培养物10 mL 接种于亚硒酸盐胱氨酸增菌液中，在36±1℃培养18～24h或48h
DHL琼脂（乎血）36±1℃培养20~24h，如有需要，培养至48h
每平血取 5个有沙门氏特征的菌落，接种在营养琼脂上，36±1C培养18~24h生化鉴定
8操作
8.1预增菌培养
结果报告
血清鉴定
取检验样品25g，加入装有225mL缓冲蛋白陈水的500mL广口瓶内（粒状可用均质器，以8000～10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎）。在36土1℃培养16～20h。8.2选择性增菌培养
取预增菌培养物10mL，接种于装有100mL四硫磺酸钠煌绿增菌液的培养瓶中，另取预增菌培养物10mL，接种于装有100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液培养瓶中，四硫磺酸钠培养瓶在43℃培养。亚硒酸盐胱氨酸培养瓶在36土1℃培养。8.3分离培养
取8.2培养物一接种环，分别划线接种在酚红煌绿琼脂平Ⅲ和DEL琼脂平Ⅲ上，为取得明显的单个菌落，取一环培养物，接种两个平血，第一个平血接种后,不烧接种环,连续在第二个平血上划线接种,将平血底部向上在36士1℃培养。必要时可取8.2培养物重复培养一次。8.3.1培养20～24h后，检查平Ⅲ中是否出现沙门氏菌典型菌落，生长在酚红煌绿琼脂上的沙门氏菌典型菌落，使培养基颜色由粉红变红，菌落为红色透明，生长在DHL培养基上的沙门氏菌典型菌落，为黄褐色透明，中心为黑色，或为黄褐色透明的小型菌落。8.3.2如生长微弱，或无典型沙门氏菌落出现时，可在36士1℃重新培养18～24h。再检验平Ⅲ是否有160
典型沙门氏菌菌落。
GB13091—91
8.3.3辨认沙门氏菌菌落，在很大程度上依靠经验，它们外表各有不同，不仅是种与种之间，每批培养基之间也有不同，此时，可用沙门氏菌多价因子血清，先与菌落作凝集反应，以帮助辨别可疑菌落8.4鉴定培养
从每种分离平Ⅲ培养基上，挑取5个被认为可疑菌落，如一个平皿上典型或可疑菌落少于5个时，可将全部典型或可疑菌落供进行鉴定。挑选的菌落在营养琼脂平Ⅲ上划线培养，在36土1℃培养18～24h，用纯培养物作生化和血清鉴定。8.4.1生化鉴定
将从8.4培养基上挑选的典型菌落，接种在8.4.1.1～8.4.1.6培养基上。8.4.1.1三糖铁培养基
在琼脂斜面上划线和穿刺，在36士1℃培养24h。培养基变化见表1。表1三糖铁培养基变化表
培养基部位
琼脂斜面
琼脂深部
红色或不变色
底蝴黄色
红色或不变色
穿刺黑色
气泡或裂缝
培养基变化
乳糖和蔗糖阳性
乳糖和蔗糖阴性
葡萄糖阳性
葡糖阴性
形成硫化氢
葡萄糖产气
典型沙门氏菌培养基，斜面显红色，底端显黄色，有气体产生，有90%形成硫化氢，琼脂变黑。当分离到乳糖阳性沙门氏菌时，三糖铁斜面是黄色的，因而证实沙门氏菌，不应仅仅限于三糖铁培养的结果。
8.4.1.2尿素琼脂培养基
在琼脂表面划线，在36土1℃培养24h，应不时检查，如反应是阳性，尿素极快的释放氮，它使酚红的颜色变成玫瑰红色～桃红色，以后再变成深粉红色，反应常在2～24h之间出现。8.4.1.3赖氨酸脱羧反应培养基
将培养物刚好接种在液体表面之下，在36士1℃培养24h，生长后产生紫色，表明是阳性反应。8.4.1.4V-P反应培养基
将可疑菌落接种在V-P反应培养基上，在36士1℃培养24h，取培养物0.2mL于灭菌试管中，加肌酸溶液2滴，充分混勾后加α-萘酚乙醇溶液3滴，充分混勾后再加氢氧化钾溶液2滴，再充分振摇混匀，在15min内，形成桃红色，表明为阳性反应。8.4.1.5靛基质反应培养基
取可疑菌落，接种于装有5mL胰蛋白陈色氨酸培养基的试管中，在36士1℃培养24h，培养结束后，加柯凡克试剂1 mL，形成红色，表明是阳性反应。8.4.1.6检查β-半乳糖苷酶的反应取-一接种环可疑菌落，悬浮于装有0.25mL生理盐水的试管中，加甲苯1滴，振摇混匀，将试管在36土1C水浴锅中放置数分钟，加ONPG试液0.25mL，将试管重新放入36土1℃水浴锅中24h，不时检查，黄色表明为阳性反应，反应常在20 min后明显出现。8.4.1.7生化试验（见表2)
可疑菌在培养基上的反应
三糖铁葡萄糖形成酸(8.4.1.1)
三糖铁葡葡糖产气(8.4.1.1)
三糖铁乳糖(8.4.1.1)
三糖铁煎糖(8.4.1.1)
三糖铁硫化氢(H,S)(8.4.1.1)
尿素分解(8.4.1.2)
赖氨酸脱羧反应（8.4.1.3）
β半乳糖苷酶反应(8.4.1.6）
V-P反应(8. 4.1.4)
靛基质反应(8.4.1.5)
8.4.2血清学鉴定
GB 13091—91
表2生化试验表
阳性或阴性
出现此反应者沙门氏菌株百分率100
以纯培养菌落，用沙门氏菌因子血清O，Vi或H型，用平板凝集法，检查其抗原的存在。8.4.2.1除去能自凝的菌株
在仔细擦净的玻璃板上，放1滴盐水，使部分被检菌落分散于盐水中，均勾混合后，轻轻摇动30～60s，对誉黑的背影观察，如果细菌已凝集成或多或少的清晰单位，此菌株被认为能自凝。不宜提供作抗原鉴定。
8.4.2.20抗原检查
用认为无自凝力的纯菌落，按8.4.2.1方法，用1滴0型血清代替盐水，如发生凝集，判为阳性。8.4.2.3Vi抗原检查
用认为无自凝力的纯菌落，按8.4.2.1方法，用1滴Vi型血清代替盐水，如发生凝集，判为阳性，8.4.2.4H抗原检查
用认为无自凝力的纯菌落接种在半固体营养琼脂中，在36士1℃培养18～20h，用这种培养物作为检查H抗原用，按照8.4.2.1方法，用1滴H血清代替盐水，如发生凝集，判为阳性。8.4.3生化和血清试验综合鉴定（见表3）表3生化和血清试验综合鉴定表
生化反应
无典型反应
无典型反应
有无自凝
血清学反应
O.Vi或H抗源阳性
全为阴性反应
未作检查
O.Vi 或H抗原阳性
全为阴性反应
注：沙门氏菌可疑菌株，送专门菌种鉴定中心进行鉴定。9
检验报告
综合以上生化试验、血清鉴定结果，报告检验样品是否含有沙门氏菌。162
被认为沙门氏菌菌株
可能是沙门氏菌
可能是沙门氏菌
可能是沙门氏菌
不认为是沙门氏菌
GB 13091—91
附录A
培养基和试剂制备
（补充件）
除特殊规定外，本标准所用化学试剂为分析纯或化学纯；生物制剂为细菌培养用；水为蒸馏水。A1缓冲蛋白陈水
A1.1成分
蛋白陈
氯化钠（GB1266）
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H,O,GB1263)磷酸二氢钾（KH2PO4GB1274)
蒸馏水
A1.1.1制法
1000mL
按上述成分配好后，校正pH，分装于大瓶中，121℃高压灭菌20min，临用时分装在500mL瓶中，每瓶225mL，或配好后校正pH，分装于500mL瓶中，每瓶225mL，121℃高压灭菌，20min后备用。A2四硫磺酸钠烛绿增菌液
A2.1基础液
A2.1.1成分
牛肉浸膏
氯化钠（GB1266）
蛋白陈
碳酸钙
蒸馏水
A2.1.2制法
将各成分加入蒸馏水中，加热至约70℃溶解，校正pH，121℃高压灭菌20min。A2.2硫代硫酸钠溶液
A2.2.1成分
硫代硫酸钠（Na2SO：·5H,O,GB637)蒸馏水
A2.3碘溶液
A2.3.1成分
碘(GB675)
碘化钾（GB1272）
蒸馏水
A2.3.2制法
1000mL
100 mL
加至100 mL
将碘化钾充分溶解于少量蒸馏水中，加入碘片，振摇玻璃瓶至碘片全部溶解，再加入蒸馏水至规定量，贮于棕色瓶内，紧塞瓶塞备用。A2.4煌绿水溶液
A2.4.1成分
蒸馏水
放在暗处，不少于1d，使其自然灭菌。A2.5牛胆盐溶液
A2.5.1成分
干燥牛胆盐
蒸馏水
A2.5.2制法
煮沸溶解，121℃高压灭菌20min。A2.6完全培养基制备
基础液
硫代硫酸钠溶液
煌绿溶液
牛胆盐溶液
GB13091—91
临用前，按上列顺序，以无菌操作，依次加入于基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加另一种成分，分装于灭菌瓶中，每瓶100mL。A3亚硒酸盐胱氨酸增菌液
A3.1基础液
A3.1.1成分
胰蛋白陈
乳糖(HG3—1000)
磷酸氢二钠（NazHPO12H,O,GB1263)亚硒酸钠
蒸馏水
A3.1.2制法
1 000 mL
溶解前三种成分于水中，煮沸5min，冷却后，加入亚硒酸钠，校正pH后分装，每瓶1000mL。A3.2L-胱氨酸溶液
A3.2.1成分
L-胱氨酸
1mol/L氢氧化钠(GB679)溶液
A3.2.2制法
在灭菌瓶中，用灭菌水将上述成分稀释到100mL，毋须蒸汽灭菌。A3.3完全培养基制备
基础液
L-胱氨酸溶液
1000mlL
基础液冷却后，以无菌操作加L-胱氨酸溶液，将培养基分装于适当容量的灭菌瓶中，每瓶100ml。注：培养基在配制当日使用。
A4酚红、煌绿琼脂
A4.1基础液
A4.1.1成分
牛肉漫膏
蛋白陈
酵母浸液粉末
磷酸氢二钠（Na2HPO4,GB1263)
磷酸二氢钠（NaH,PO4,GB1267）琼脂
蒸馏水
A4.1.2制法
GB13091--91
将上述成分加水煮沸溶解，校正pH,121℃高压灭菌20min。A4.2糖、酚红溶液
A4.2.1成分
乳糖(HG 3-1000)
蔗糖(HG 3—1001)
酚红(HG 3—959)
蒸馏水
A4.2.2制法
将各成分溶解于水中，在70℃水浴锅中加温20min，冷却至55℃立即使用。A4.3煌绿溶液
见A2.4条。
A4.4完全培养基制备
基础液
糖、酚红溶液
12~18g
加至100 mL
在无菌条件下，将煌绿溶液加入到冷却至约55℃的糖、酚红溶液中，再将糖、酚红、煌绿溶液加入到50～55℃基础液中混合。
A4.5琼脂平血制备
将A4.4制备的培养基在水浴锅中溶解，冷却至50～55℃，倾注入灭菌的平Ⅲ中。大号平Ⅲ，倾入约40ml，小号平Ⅲ，倾入约15mL，待凝固后备用，平血在室温保存，不超过4h，在冰箱保存，不超过24h。A5DHL琼脂
A5.1成分
蛋白陈
牛肉浸膏
乳糖（HG3—1000）
蔗糖(HG3-1001)
去氧胆酸钠
硫代硫酸钠（GB637)
柠檬酸钠（HG3—1298）
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中性红
蒸馏水
A5.1.1制法
GB13091-91
18~20g
1000mL
将除中性红和琼脂以外的成分溶解于400mL蒸馏水中，校正pH，再将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，加入0.5%中性红水溶液6mL，待冷却至50~55℃，倾注平皿。A6营养琼脂
A6.1成分
牛肉浸膏
蛋白陈
蒸馏水
A6.1.1制法
将上述各成分煮沸溶解，校正pH，121℃高压灭菌20min。A6.1.2平血制备
9~18 g
1 000 ml
将A6.1.1制备的营养琼脂在水浴锅里溶解，冷却至50～55℃时，倾注入灭菌平Ⅲ中，每约15mL。
A7 三糖铁琼脂
A7.1成分
牛肉漫膏
酵母浸膏
蛋白陈
氯化钠（GB1266）
乳糖(HG 3-—1000)
糖(HG 3—1001)
葡药糖(HG3-1094)
柠檬酸铁
硫代硫酸钠（GB637)
酚红（HG3—959)
蒸馏水
12～18g
1000mL
A7.1.1制法
将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂，再加入0.2%酚红溶液12mL，播匀，分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层，121℃高压灭菌20min，放置高层斜面备用。
A8尿素琼脂
A8.1基础液
A8.1.1成分
蛋白陈
葡萄糖（HG3—1094）
氯化钠（GB1266）
磷酸二氢（KH,PO,GB1274）
酚红(HG 3--959)
蒸馏水
A8.1.2制法
GB13091-
将上述成分溶于水中，煮沸，校正pH，121℃高压灭菌20 min。A8.2尿素溶液
A8.2.1成分
蒸馏水
A8.2.2制法
将尿素溶于水中，通过滤器除菌，并应检查灭菌情况。A8.3完全培养基制备
基础液
尿素溶液
12～18g
1 000mL
加至1 000 mL
在无菌条件下，将尿素溶液加到事先溶化并冷却至45℃基础液中，分装试管，放置成斜面备用。A9赖氨酸脱羧试验培养基
A9.1成分
L-赖氨酸盐酸盐
酵母浸膏
葡萄糖（HG3--1094）
溴甲酚紫
蒸馏水
A9.1.1制法
1000mL
将上述各成分溶于水中煮沸，校正pH，分装于小试管中，每支约5mL，121℃高压灭菌10min，备用。
V-P反应培养基
A10.1成分
蛋白陈
葡萄糖（HG3-1094）
磷酸氢二钾
蒸馏水
A10.1.1制法
1 000 mL
将上述成分溶于水中，加热溶解，校正pH，分装在小试管中，每支约分3mL，115℃高压蒸汽灭菌167
20 min。
A10.2肌酸溶液
A10.2.1成分
肌酸单水化合物
蒸馏水
A10.2.2制法
将肌酸单水化合物溶于水中，备用。A10.3α-萘酚乙醇溶液
A10.3.1成分
α-萘酚
96%乙醇(GB679)
A10.3.2制法
将α-萘酚溶于乙醇溶液中。
A10.4氢氧化钾溶液
A10.4.1成分
氢氧化钾（GB2303）
蒸馏水
A10.4.2制法
将氢氧化钾溶于水中。
A11靛基质反应培养基
A11.1成分
胰蛋白陈
氯化钠（GB1266）
DL-色氨酸
蒸馏水
A11.1.1制法
GB 13091—91
1000mL
将上述各成分溶解于100℃水中，过滤，校正pH，分装于小试管中，每支5mL，121℃高压灭菌15 min。
A11.2柯凡克试剂
A11.2.1成分
对二甲氨基苯甲醛
盐酸（GB622）
A11.2.2制法
将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后缓缓加入浓盐酸。A12β-半乳糖苷酶试剂
A12.1缓冲液
A12.1.1成分
磷酸二氢钠(NaH,PO4,GB1267)
0.1mol/L氢氧化钠（GB679)溶液168
蒸馏水
A12.1.2制法
GB13091---91
加至50mL
将磷酸二氢钠溶于大约45mL水中，用氢氧化钠调pH为7.0,加水至最后容量50mL，贮存于冰箱中备用。
A12.2ONPG溶液
A12.2.1成分
邻硝基酚β-D-半乳糖苷(ONPG)
蒸馏水
A12.2.2制法
将NPG溶解于50℃水中后冷却。
A12.3完全试剂制备
缓冲液
ONPG溶液
将缓冲液加入到 ONPG溶液中。
半固体营养琼脂
A13.1成分
牛肉浸膏
蛋白陈
蒸馏水
A13.1.1制法
将上述成分溶于水中，校正pH，121℃高压灭菌20min。A14盐水溶液
A14.1成分
氟化钠（GB1266）
蒸馏水
A14.1.1制法
将氯化钠溶解于水煮沸，校正pH后分装，121℃高压灭菌20min。附加说明：
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由中国兽药监察所负责起草。本标准主要起草人李公喆、杨玮云。80mg
4～5g
1 000 mL
1000mL
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