中华人民共和国农业行业标准
NY293-95
苏云金芽孢杆菌制剂
1995-06-06发布
中华人民共和国农业部发布
1995-10-01实施
中华人民共和国农业行业标准
苏云金芽孢杆菌制剂
主题内容与适用范围
NY293-95
本标准规定了苏云金芽孢杆菌制剂（可湿性粉剂和悬浮剂的技术要求、检验方法、检验规则以及标志、包装、运输、贮存。
本标准适用于微生物发酵方法制得防治鳞翅目害虫的苏云金芽孢杆菌制剂（可湿性粉剂和悬浮剂)。
本标准不适用于加有化学农药的苏云金芽孢杆菌复配制剂。2
引用标准
GB/T1600
GB/T1601
GB/T1604
GB/T1605
GB3796
农药水分测定方法
农药pH值的测定方法
农药验收规则
商品农药采样方法
农药包装通则
GB/T5451
农药可湿性粉剂湿润性测定方法HG/T2—896
3技术要求
农药粉剂细度测定方法
3.1外观：可湿性粉剂为灰白色一棕褐色粉，悬浮剂为棕黄色一褐色悬浮液体。3.2
苏云金芽孢杆菌制剂还应符合表1要求：表1
毒力效价[PxIU/mg(μL)]
[Ha IU/mg(μL)])
细度，μm
悬浮率(有效成分)，%
湿润时间，min
含水量，%(m/m）
≥32000
可湿性粉剂
≥16 000
≥8000
98%≤75μm(200目筛）
≥8000
悬浮剂
≥4 000
≥2000
100%≤180μm（80目筛）
98%≤150μm(100目筛）
注：1）Px和Ha分别为Plutellazylostella(小菜蜕）和Heliothisarmigera(棉铃虫）的缩写。中华人民共和国农业部1995-06-06批准1995-10-01实施
4检验方法
NY293—95
4.1毒力测定方法一：用小菜蛾（Plutellazylostella）作试虫的测定方法[小菜蛾饲养方法见附录A（补充件)(仲裁法）。
4.1.1试剂或材料
标准品：CS-95，Hab，效价20000IU/mg；4.1.1.1
4.1.1.2小菜蛾幼虫：Plutellazylostella；4. 1. 1. 3
4. 1. 1. 4
4. 1. 1. 5
4. 1. 1.7
4. 1. 1. 10
4. 1. 1. 11
4. 1. 1.12
4. 1. 1. 13
4. 1. 1. 14
4. 1. 1. 15
4. 1. 1. 16
4. 1. 1. 17
水，灭菌；
4. 1. 1. 18
食用菜籽油；
酵母粉：工业用；
维生素C：医用，分析纯：
琼脂粉：凝胶强度大于300g/cm；磷酸氢二钾（HG31228）：分析纯；磷酸二氢钾（GB1274）：分析纯；聚山梨酯-80：粘度3.5×10-4~5.5×10-m2/s；菜叶粉：甘蓝型油菜叶，80℃烘干，磨碎，过80目筛；薰糖（HGB3310）：分析纯；
纤维素粉CF-11；
氢氧化钾（GB/T2306）：分析纯；氯化钠（GB1266）：分析纯；
15%尼泊金：对羟基苯甲酸甲酯（化学纯)溶于95%酒精；10%甲醛溶液：甲醛（GB685，分析纯）溶于蒸馏水；干酪素溶液：干酪素(BR生物试剂)2g加2mL1mol/m氢氧化钾（4.1.1.13），8mL蒸馏磷酸缓冲液：氯化钠(4.1.1.14)8.5g；磷酸氢二钾（4.1.1.7)6.0g，磷酸二氢钾（4.1.1.8）3.0g；聚山梨酯-80(4.1.1.9)溶液0.1mL；蒸馏水1000mL。4.1.2仪器
4. 1.2. 10
磨口三角瓶：250mL；免费标准vv99.net
分析天平：精确度0.1mg；
电动搅拌器：无级调速，100~6000r/min；医用手术刀；
振荡器；
水浴锅；
养虫管：9cm×2.5cm；
烧杯：50mL；
试管：18mmX180mm；
玻璃珠：95mm；
移液管：10mL。
4.1.3测定步骤
4.1.3.1感染液的配制
标准品：用分析天平（4.1.2.2)准确称取标准品（4.1.1.1)100.0~150.0mg，精确到0.1mg，a.
装入250mL装有10粒玻璃珠（4.1.2.10)的磨口三角瓶（4.1.2.1)中；加入100mL磷酸缓冲液（4.1.1.18），浸泡10min，在振荡器（4.1.2.5）上振荡30min；得到浓度约为1mg/mL的标准品母液（该母液在4℃冰箱中可存放10d）；然后将标准品母液稀释成浓度为（1.000，0.500，0.250，0.125，0.0625，2
0.0313mg/mL）的六个稀释感染液。NY293-95
b.可湿性粉剂样品：称取相当于标准品毒力效价的样品适量，精确到0.2mg，加100mL磷酸缓冲液，然后参照标准品的配制方法配制样品感染液。c悬浮剂样品：将样品用力振荡20min，充分摇匀；用移液管（4.1.2.11)吸取样品10.00mL，精确到0.01mL，加入装有90mL无菌蒸馏水的磨口三角瓶中，吸洗三次，充分摇匀得到含100μL/mL的母液；将母液稀释成含量分别为5.000，2.500，1.250，0.625，0.313和0.156μL/mL的六个稀释液。对有些效价过高或过低的样品在测定前需先以3个距离相差较大的浓度做预备试验，估计LCs值（半致死中浓度)的范围，据此设计稀释浓度。4.1.3.2感染饲料的配制
饲料配方：维生素C(4.1.1.5)0.5g、干酪素溶液（4.1.1.17)1.0mL、菜叶粉（4.1.1.10)3.0g、酵母粉(4.1.1.4)1.5g、纤维素粉(4.1.1.12)1.0g、琼脂粉(4.1.1.6)2.0g、蔗糖（4.1.1.11)6.0g、菜籽油（4.1.1.3)0.2mL、10%甲醛溶液（4.1.1.16)0.5mL、15%尼泊金（4.1.1.15)1.0mL、蒸馏水100mL。
将蔗糖、酵母粉、干酪素溶液、琼脂粉加入90mL的蒸馏水中调匀；搅拌煮沸，使琼脂完全熔化，加入尼泊金，搅匀；将其他成分用剩余的10mL蒸馏水调成糊状；当琼脂冷却至75℃左右时与之充分混合，搅匀，置55℃C水浴锅（4.1.2.6)中保温备用。取50mL的烧杯（4.1.2.8)7只，写好标签，置55℃水浴中预热；分别向每个烧杯中加入1mL对应浓度的感染液，缓冲液作空白对照；向每个烧杯中加入9mL熔化的感染饲料；用电动搅拌器（4.1.2.3)搅拌20s，使每个烧杯中的感染液与饲料充分混匀。将烧杯静置，待冷却凝固后，用医用手术刀（4.1.2.4)将感染饲料切成1cm×1cm的饲料块，每个浓度取4个饲料块分别放入4支养虫管（4.1.2.-7)中，每管放入一块，写好标签。4.1.3.3接虫感染
随机取已放置饲料的养虫管，每管投入10头小菜蛾三龄初幼虫（4.1.1.2），每浓度4管，塞上棉塞，写好标签，在相同饲养条件下饲养。4.1.4结果检查及计算
感染48h后检查试虫的死亡情况。判断死虫的标准是以细签轻轻触动虫体，无任何反应者判为死亡。
计算标准品和样品各浓度的供测昆虫死亡率，查Abbott表或用式（1)计算校正死亡率（X，）。对照死亡率10%以下需要校正，大于10%则试验结果无效。X,(%):
式中：T处理死亡率；
C—对照死亡率。
（1）
将感染液各浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡机率值，用最小二乘法或有统计功能的计算器，分别求出标准品LCso值和待测样品LCso值，然后按式（2)计算待测样品的毒力效价[X，PxIU/mg(μL)或HaIU/mg(μL)J：
式中：S—标准品LCse值；
P-标准品效价；
Y—样品LCso值。
4.1.5允许差
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毒力测定法允许相对偏差，但每个样品3次重复测定结果最大偏差不得超过20%。毒力测定制剂各浓度所引起的死亡率应在10%～90%之间，在50%死亡率上下至少要各有两个浓度。4.2毒力测定方法二：以棉铃虫（Heliothisarmigera）作试虫的测定方法[棉铃虫饲养方法见附录A（补充件)。
4.2.1试剂或材料
4.2.1.1标准品：CS-95,Hab，效价20000IU/mg4.2.1.2
棉铃虫幼虫：Heliothisarmigera黄豆粉：黄豆炒熟后磨碎过60目筛；大麦粉：过60目筛；
酵母粉：工业用；
36%乙酸溶液：乙酸（GB676)，化学纯，溶于蒸馏水；苯甲酸钠：分析纯；
甲醛（GB685）：分析纯；
维生素C：医用，分析纯；
琼脂粉：凝胶强度大于300g/cm；4. 2. 1.11
磷酸缓冲液：同4.1.1.18。
4.2.2仪器
分析天平：精确度0.0001；
电动搅拌器：无级调速，100~6000r/min；微波炉或电炉；
振荡器；
水浴锅；
组织培养盘：24孔；
塘瓷盘：30cm×20cm；
磨口三角瓶：250mL，具塞；
大烧杯：1000mL；
小烧杯：50mL；
试管：18mmX180mm；
玻璃珠：$5mm；
注射器：50mL；
标本缸；
4.2.2.15恒温培养箱。
4.2.3测定步骤
4.2.3.1饲料制备
饲料配方：酵母粉(4.2.1.5)12g、黄豆粉(4.2.1.3)24g、维生素C(4.2.1.9)1.5g、苯甲酸钠(4.2.1.7)0.42g、36%乙酸（4.2.1.6)3.9mL、蒸馏水300mL。将黄豆粉、酵母粉、维生素C、苯甲酸钠和36%乙酸放入大烧杯（4.2.2.9)内，加100mL蒸馏水湿润，另将余下200mL蒸馏水加入琼脂粉（4.2.1.10)内，在微波炉（4.2.2.3)上加热至沸腾，使琼脂完全熔化，取出冷却至70C，即与其他成分混合，在电动搅拌器（4.2.2.2)内高速搅拌1min，迅速移至60℃水浴锅（4.2.2.5)中加盖保温。4.2.3.2感染液的配制
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称100.0～150.0mg可湿性粉剂样品，精确到0.1mg，至盛有玻璃珠（4.2.2.12）的磨口具塞三角瓶（4.2.2.8)中，加磷酸缓冲液（4.2.1.11)100mL，浸泡10min，在振荡器（4.2.2.4）上振荡1min即成母液。或将悬浮剂样品充分振荡均匀后，吸取1.00mL，精确到0.01mL，至盛有玻璃珠的磨口具塞三角瓶中，加磷酸缓冲液99mL，漫泡10min，在振荡器上振荡1min即成母液。于分析天平（4.2.2.1)上称取150.0~300.0mg标准品（4.2.1.1)，精确到0.1mg，如上法制成母液。将样品和标准品母液用磷酸缓冲液以一定的倍数等比稀释，每个样品和标准品至少各稀释5个浓度，并设一缓冲溶液作对照，每-一浓度感染液吸取3mL至50mL小烧杯（4.2.2.10)内待用，对照吸取3mL磷酸缓冲液。4.2.3.3饲料和感染液的混合及分装用注射器（4.2.2.13)吸取27mL饲料，注入上述已有样品或标准品感染液的烧杯内，以电动搅拌器高速搅拌0.5min，迅速倒入组织培养盘（4.2.2.6)上各小孔中（倒入量不要求一致，以铺满孔底为准），凝固待用。
4.2.3.4接虫感染
于26～30℃室温下，将未经取食的初孵幼虫（4.2.1.2)(孵化后12h内）抖入直径20cm的标本缸（4.2.2.14)中，静待数分钟选取爬上缸口的健康幼虫作供试虫，用毛笔轻轻地将它们移入已有感染饲料的组织盘的小孔内，每孔一头虫。每个浓度和空白对照皆放48头虫，用塑料薄片盖住，然后将组织培养盘逐个叠起，用橡皮筋捆紧，竖立放于30℃恒温培养箱（4.2.2.15)内培养72h。4.2.4结果检查和统计分析
用肉眼或放大镜检查死、活虫数，以细签触动虫体，完全无反应的为死虫，计算死亡率。如对照有死亡，可查Abbott校正值表或按式（1)计算校正死亡率。对照死亡率在6%以下不用校正，6%～15%之间需校正，大于15%则测定无效。将浓度换算成对数值，死亡率或校正死亡率换算成机率值，用最小二乘法或有统计功能的计算器，分别求出标准品和样品的LCso，按式（2)计算毒力效价。4.2.5允许差
毒力测定方法的允许偏差要求与4.1.5相同。4.3pH值测定
按GB/T1601中规定的pH试纸法进行。4.4悬浮率测定
4.4.1仪器和试剂
4.4.1.1量筒：250mL，具塞，0和250刻度间距离为20～21.5cm，25mL刻度线与塞子底部之间的距离为4~6cm。
4.4.1.2吸液管：长30～40cm，内径0.5cm，末端内径为0.3cm，将其变成U形，U形部分高为0.5~1.01cm，其管口向上。
4.4.1.3秒表。
三角玻璃瓶：500mL。
4. 4. 1.6
恒温水浴锅。
标准硬水：以碳酸钙计具有342Ppm硬度，其配制方法按GB5451中标准硬水配制方法进4.4.1.7三角玻璃瓶：100mL。
4.4.2测定步骤
4.4.2.1可湿性粉剂
称取样品200.0mg，精确到0.2mg，放入盛有玻璃珠的三角瓶（4.4.1.4)中，加入标准硬水（4.4.1.6)100mL，用手左右振荡60次。制得的悬浮液全部转移到250mL具塞量筒（4.4.1.1)中，用标准硬水加到250mL。
将量简放入30士1℃恒温水浴锅（4.4.1.5)中，当悬浮液温度达到30℃时，将量简盖好，拿起量简先5
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轻轻摇起沉淀物，然后有规律地以量简中部为中心上下颠倒15个来回（约30s），使呈均匀的悬浮液，量筒简仍放入恒温水浴中，打开盖子，静置30min后，用吸液管（4.4.1.2)以抽气法将量简上部9/10的悬浮液抽出（在15～30s内完成）。抽液过程中吸液管应依附简壁随液面下降而下降，勿使下部沉淀搅动，量简内剩下1/10部分，按4.1或4.2毒力测定法测定毒力。4.4.2.2悬浮剂
样品摇匀后吸取5.00mL，精确到0.01mL，于100mL三角玻璃瓶（4.4.1.7)中，加入标准硬水100mL，用手左右振荡50次。制得的悬浮液全部转移到250mL具塞量简中，用标准硬水加到250mL。然后按4.4.2.1中“将量简放入30士1℃恒温水浴锅（4.4.1.5)中，...”进行。4.4.3分析结果的计算
根据式(3)计算悬浮率(Xs)：
X;(%) = 11. 1(10C - Q)
式中：C-样品的毒力效价，IU；Q—留在量筒的25mL悬浮液的毒力效价，IU。4.4.4允许差
本法允许偏差，但三次重复测定结果最大偏差不得超过20%。4.5细度测定
4.5.1可湿性粉剂细度测定
按HG/T2—896中湿筛法进行。
4.5.2悬浮剂细度测定
吸20.00mL试样，准确至0.01mL，按HG/T2—896中湿筛法测定方法进行。4.6可湿性粉剂湿润时间测定
按GB5451进行。
4.7可湿性粉剂含水量测定
按加热比重法或GB/T1600中共沸法进行测定，共沸法为仲裁法。5检验规则
（3）
5.1产品由质量检查员按GB/T1604、GB/T1605负责进行检验，并保证出厂产品符合标准要求，每批出厂成品在包装箱上附有产品名称、毒力效价、批号、净重、生产日期，质量保证期及农药登记证号和标准号，出厂时进行检验。
5.2本产品以同时发醇酵放罐的容量为一批，按GB1605进行取样。5.3如在检验中，有一项指标不符合标准，则应重新加倍取样，重新检验，即使项指标不符合本标准要求，则整批产品为不合格。
5.4当供需双方对产品的质量发生异议时，可由双方协商解决或由国家法定机构按照本标准规定的检验方法进行仲裁分析。
6标志、包装、运输、贮存
6.1产品包装应符合GB3796规定。6.2可湿性粉剂产品主要采用塑料袋包装，密封。悬浮剂产品主要采用1L塑料壶包装，壶有内外盖，不泄漏。
6.3贮存时严防日晒，勿受压，置于阴凉干燥处。6
6.4运输时，注意轻放、防止损坏。6.5质量保证期
6.5.1可湿性粉剂
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质量保证期二年，在正常贮运条件下，两年内产品毒力效价不低于3.2条指标的80%。悬浮剂
质量保证期一年半，本产品出厂时毒力效价不低于3.2条规定的指标。在正常贮运条件下，一年半内效价不低于3.2条指标的70%。A1小菜蛾的饲养
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附录A
供试虫的饲养方法
(补充件）
用天然饲料·甘兰型油幼苗饲养。A1.1饲料的培植
A1.1.1培养基质
选择直径为2～3mm的蛭石，在42cmX32cmX3.5cm的塘瓷盘中铺约3cm厚。A1.1.2油菜籽播种
挑选健壮饱满的油菜籽，播种前用清水浸泡10h，然后将油菜籽均匀撤在蛭石表面，再盖一薄层干蛭石，每盘播种油菜籽1517g。
A11.3培植条件
播完油菜籽浇水后，将糖瓷盘置手相对湿度65%～75%，温度25士1℃的条件下，使之发芽。在幼苗培养期间，必须控制以下条件：A1.1.3.1浇水量：播种时，每盘浇水以蛭石饱和吸收为度，从第三天开始每天浇水一次，每次浇水量应根据室外天气和室内湿度严格控制。A1.1.3.2光照：种子萌发后，应立即加强光照。在气温适宜，天气晴朗时，可利用太阳光，在室外日照5~7h。室内人工光照宜选用日光灯，室内光照应保证光照强度至少在5000～60001x的范围内，光照时间为14～16h。
A1.2幼虫的饲养
小菜蛾幼虫孵出后，在相对湿度为65%～75%，温度为25士1℃的养虫室内饲养，光照强度1000～4000lx，光照时间为14～16h/d。A1.2.1幼虫的接入和饲养
A1.2.1.1幼虫的接入方法：将收集有卵的成虫饲养笼置于油菜幼苗上，初孵幼虫从笼底小孔中爬出，吐丝下坠，落到油菜子叶上，取食子叶。A1.2.1.2幼虫接入量：为了保证虫龄和虫体大小基本一致，接入幼虫应该适量。在卵孵化高峰期，同一产卵笼应在早上8：00和晚上8：00分别转入新鲜幼苗上，使每盘幼虫的开始取食时间相差12h，这样，可将感染时间控制在上午8：00和下午4：00。在这种条件下，幼虫生长72～84h，以二龄幼虫为主，幼虫生长120～132h，以三龄幼虫为主。应严格要求饲养生理状态一致的健壮幼虫作为质量检测的供试虫。A1.3蛹的收集和成虫的饲养
A1.3.1蛹的收集
用小镊子从叶片或茎上取下成熟的蛹茧放入成虫饲养笼使其羽化。每笼约250～300头。成虫饲养笼由24cmX15cm×11cm铝金属骨架组成，四周围有透明塑料薄膜，由四只撑脚支起。使用前，将笼底塑料薄膜刺满直径1.5mm左右的小孔。A1.3.2成虫的饲养和产卵
将饱含10%葡糖溶液的脱脂棉球放入成虫饲养笼中，供成虫取食，每天更换一次。羽化后，成虫当天即交配产卵，第四天至第五天开始孵化，第六天至第八天为卵孵化高峰期。8
2棉铃虫的饲养
用人工饲料饲养。
A2.1饲料制备
A2.1.1组成
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黄豆粉80g、酵母粉40g、大麦粉60g、乙酸14mL、苯甲酸钠1g、维生素C5g、苯甲酸1g、琼脂14g、蒸馏水1000mL（上述量可饲养200头幼虫）。A2.1.2步骤
将黄豆粉、酵母粉、维生素C、大麦粉和乙酸放入烧杯内，加300mL蒸馏水湿润，另将余下的水与琼脂一起在微波炉或电炉上加热至沸使琼脂完全熔化，取出待琼脂冷却至70C时，与其他成分混合，在揽拌器内高速搅拌1min，倾入塘瓷盘内冷却2h，待用。A2.2幼虫饲养
A2.2.1前期饲养
将饲料切割成1cm×1cm×1cm小块，分装入24孔组织盘各孔中，每孔一块并接入初孵幼虫1~2头，盖上盖，置30士1℃，相对湿度50%～60%的养虫室饲养6d，每天光照14h。A2.2.2后期饲养
将上述饲料切成0.5cm×2cm×1.8cm小块，分装入190孔养虫盘各孔中，每孔1块并接入已培养6d的幼虫，置同一养虫室饲养6d，至幼虫老熟。A2.3蛹的收集及成虫、卵的培养A2.3.1老熟幼虫移入盛有砂壤土的标本缸内，置30士1℃弱光下化蛹，10d后移入铁纱笼内。A2.3.2将盛有蛹的铁纱笼移入25士1℃、相对湿度80%以上的室内羽化，羽化成虫喂10%葡萄糖水，在笼内交配产卵，卵产于封笼口的纱布上。A2.3.3卵用4%甲醛浸泡灭菌20min，取出清水漂洗3次，晾干，置标本缸内，在30士1℃条件下孵化，初孵幼虫大部分作测定用，一部分作种虫。附加说明：
本标准由农业部标准司提出。
本标准由农业部农业司归口。
本标准由农业部农药检定所、华中农业大学、湖北农科院和中国农业科学院生物防治研究所负责起草。
本标准主要起草人顾宝根、喻子牛、钟连胜、陈建峰、罗曦霞、姜辉、吴继星、陈景芬。中华人民共和国农业
行业标准
苏云金芽孢杆菌制剂
NY293—95
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
话：8522112
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售版权专有
不得翻印
开本880×1230
1996年3月第一版
印张3/4
字数18千字
1996年3月第一次印刷
印数1-1500
书号：155066·2-10321
定价3.50元
标目284-50
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