本标准规定了鸡传染性贫血病毒聚合酶链反应的技术要求。本标准适用于鸡血清和组织中的鸡传染性贫血病毒检测。

ICS11.220
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1187-2006
鸡传染性贫血病毒聚合酶链反应试验方法Polymerase chain reaction for chicken infectious anemia virus2006-07-10发布
2006-10-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T1187—2006
鸡传染性贫血（ChickenInfectiousAnemia）是由鸡传染性贫血病毒（ChickenInfectiousAnemiaVirus）引起的一种传染病，主要损害鸡的造血和淋巴器官，引起维鸡再生障碍性贫血和全身淋巴组织娄缩，导致免疫功能抑制，已成为危害养鸡业的重要疫病之本标准附录A为规范性附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准主要起草人：田克恭、王宏伟、孙明、王传彬、陈西钊。I
1范围
鸡传染性贫血病毒聚合酶链反应试验方法本标准规定了鸡传染性贫血病毒（CAV）聚合酶链反应（PCR）的技术要求。本标准适用于鸡血清和组织中的鸡传染性贫血病毒检测。2试剂
2.1消化液（见附录A.1)
2.22%蛋白酶K溶液
2.3酚/氯仿/异戊醇混合液（见附录A.2）2.42.5mmol/LdNTP
2.58mmol/L上下游引物混合液（引物序列见附录A.3）2.60.5U/μLTaqDNA聚合酶
2.710×PCR缓冲液
2.81%溴化乙锭（EB)溶液
2.9TAE电泳缓冲液
2.101%琼脂糖凝胶
2.11上样缓冲液（见附录A.4）
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2.12其他试剂：异丙醇（分析纯）100bpMarker、75%乙醇溶液、15mmoL/L氧化镁溶液、灭菌双蒸水。
3实验室条件
3.1实验室必领为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)以上实验室。3.2实验室分区：PCR试验区域分PCR反应液配制区一配液区模板提取区、扩增区、电泳区；流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区→电泳区。严禁器材和试剂倒流。3.3实验室应配备的仪器及耗材
3.3.1仪器：分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪，电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮罐或-70冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃C冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为2pL20200L1000)
3.3.2耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌高心管、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖，500mL量筒，500mL锥形瓶、吸头（10μL200μL、1000L），灭菌双蒸水。4操作程序
4.1样品的采集与处理
4.1.1样品的采集：濒死鸡扑杀鸡敢肝脏；待检活鸡，用注射器取血2mL～4mL，立即送往实验室。4.1.2样品的处理：每份样品分别处理。4.1.2.1组织样品处理：取待检病料约0.2g置研磨器中剪碎并研磨，加人2mL消化液继续研磨。取已研磨好的待检病料上清200L，置1.5mL灭菌离心管中，再加人400消化液和10L蛋白酶K溶1
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液，混匀后，置55℃水浴中4h~16h。4.1.2.2血清样品处理：待血液凝固后取血清放于离心管中，4℃8000g离心5min，取上清200L，置1.5mL灭菌离心管中，加入400L消化液和10pL蛋白酶K溶液，混勾后，置55C水浴中4h16h。4.1.2.3阳性对照处理：取鸡传染性贫血病毒细胞培养液200uL，置1.5mL灭菌离心管中，加人400pL消化液和10μL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中4h~16h。4.1.2.4阴性对照处理：取SPF鸡血清200uL，置1.5mL灭菌离心管中，加人400L消化液10L蛋白酶K溶液，混匀后，置55C水浴中4h16h4.2DNA模板的提取
4.2.1取出已处理的待检样品及阴性、阳性对照，每管加人600μL酚/氯仿/异戊醇混合液，用力颠倒10次混匀，13000g离心10min
4.2.2取上清置1.5mL灭菌离心管中，加人等体积异丙醇，混勾，置液氮中3min或-70C冰箱中30min。取出样品管，室温融化，-4℃20000g离心15ming4.2.3弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴人-20℃预冷的75%乙醇液1mL，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣干吸水纸上1min，真空抽干15mine4.2.4取出样品管，用50uL灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。4.3PCR扩增：每管取灭菌双蒸水8uL2.5mmol/LdNTP、8mmol/LCAV引物、15mmol/L氯化镁、10×PCR缓冲液、0.5U/uLTagDNA聚合酶各2uL，DNA模板2L。混勾，作好标记，加入矿物油20μL，覆盖（有热盖的自动DNA热循环仪不用加矿物油）。扩增条件为94℃C30s，58℃30s72℃30s35个循环后，72℃延伸7ming
4.4电泳
将PCR扩增产物15uL与3L上样缓冲液混合，加样于1%琼脂糖凝胶孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加人100bpLadderMarker（分子量标准物），以5V/cm电压电泳40min，用紫外凝胶成像仪观察结果。
5结果判定
当阳性对照出现675bp扩增带，阴性对照未出现目的带时，实验结果成立。被检样品出现675bp扩增带为CAV阳性，未出现相应扩增带的样品判为阴性。A.1消化液的配制
附录A
（规范性附录）
试剂的配制
A.1.11mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCL)(pH8.0)三羟基甲基氨基甲烷
灭菌双蒸水
浓盐酸
灭菌双蒸水
A.1.20.5mol/L乙二铵四乙酸二钠EDTA)溶液（pH8.0）二水乙二铵四乙酸二钠
灭菌双蒸水
氢氧化钠
灭菌双蒸水
A.1.320%十二烷基硫酸钠溶液（pH7.2）十二烷基硫酸钠
灭菌双蒸水
浓盐酸
灭菌双蒸水
A.1.4消化液
1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCL)（pH8.0）0.5mol/乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）20%十二烷基硫酸钠溶液（pH7.2)5mol/L氯化钠
灭菌双蒸水
酚/氯仿/异戊醇混合液
碱性酚
异戊醇
引物序列
调pH至8.0
加至100mL
调pH至8.0
加至100mL
调pH至7.2
加至100mL
加至200mL
GACTGTAAGATGGCAAGACGAGCTC3
上游引物PVV99.net
下游引物P
A.4上样缓冲液
GGCTGAAGGATCCCTCATTC3
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溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。50g蔗糖加人50mL水溶解后，移人已溶解的溴酚蓝溶3
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液中，摇勾定容至100mL。
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