本标准规定了动物源性饲料中鹿源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为0.1%（质量分数）。本标准适用于动物源性饲料中鹿源性成分的定性检测。

ICS 65. 120
中华人民共和国国家标准
GB/T21106—2007
动物源性饲料中鹿源性成分定性检测方法
PCR方法
Identification of Ccrvus derived matcrials in animaloriginated feedstnffs-PCR method2007-10-24发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-04-01实施
本标推的附录A为资料性附录。
本标推由中华人居共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。GB/T 21106--2007
本标准超草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局,中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标雄主要起草人：陈巍、吴亚君,徐宝璨，正晶、钱增敏、宗卉、曹际娟、高宏伟、黄义胜、袁飞、赵贵明。
本标准肯次发布。
http：/
1范围
动物源性饲料中鹿源性成分定性检测方法PCR方法
GB/T21106—2007
本标准规定了动物源性饲料中鹿（Cervus）源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为0.1%（质量分数）。
本标准适用于动物源性
饲料中康源性成分的定性检测。INA
规范性引用文件
过本标准的引用而城
下列文件中的务
请误的内容）或修订版均不适
的修改单（不包括）
是否可使用这些
GB6682
GB/T146
标准的条款
凡是注日期的引用文件，其随后所有订本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究最新版本
凡是不注日期
的引用文件，其最新版本适用于本标准。验室用水规格和试验方法
饲料来祥GB/T
14699.1-2005.ISO6497:2002.IDT91
SN/T119
因检验实验室技术要求
术语和定义
下列术语
聚合酶链式
用于扩增位
适用于本标准
polymerase chain
reaction;PCR
投已知序列之间DNAC
acid，脱氧核糖核酸）的方法。模板deoxyribonucleosidea
生成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分DNA经过高温变
内来区人的一段五补序列发生退别与模板DNA两
oxyribonucleo side thoo
和DNA合成这一循环，
循环，扩增倍数达到约
4原理
聚合酯的催化下以4种dNTP(de-
，接着在DNA
，为底物，使退火引物得以建伸，如此反复变性，退火氧校苷酸三
ate，脱
于两段已知序列之问的DNA片段呈几何倍数产增，经25个～30个扩增利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，无水乙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证。5试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB6682的要求。5.1鹿源性成分检测用引物（对）序列为：F.5-TCATCGCAGCACTCGCTATAGTACACT-3R:5-ATCTCCAAGCAGGTCTGGTGCGAATAA-35.2TagDNA聚合酶（Taq，Thermusaquaticu，水生栖热菌）。5.3限制性内切酶AluI酶。
5.4dNTPsdATP(deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺三磷酸），dTTP(deoxythymidinetriphoshttp：//
unwurfooo
atono:
GB/T 21106—2007
phate脱氧胸古三磷酸），dCTP（denxyeytidinetriphusphate，脱氧脑节三磷酸）.dGTP（deoxyguanosinetriphosphate,脱氧鸟苷三磷酸）：5.5琼脂糖：电纯。
5.6换化乙锭。
5.7三氛甲烧：
5.8无水乙醇。
5.970%乙醇：
5. 10 DVA 分子量标准品(100 bp ~600 bp)(bp;base pair:碱基对),5.11裂解波：1%CTAB(cctyltrithylarmmoniumbramide，[六烷基三甲基溴化铵），0.Q5mol/1Tris-HCl(pH8.0)Tris\:1ris（hydraxymethyl)aminomethanc,三(羟甲基)氨基甲烷」,0.7mol/LNaClD.01mol/LEDTA(pII8.0)(ethylenediaminetelraacetic acid,Z二胺四乙酸)。5. 12TE 绥冲液(Tris-HCl,EDTA 缓冲液): 10 mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 1 mmol/L EDTA(p118.0)
5.1310XPCR缓冲液:100 mmol/L KCl,160 mmnl/L (NII4),SO,20 timol/1.MgSO,.200 mmol/LTris-HCl（pH8.8)，1%TritonX-100（t-octylphenoxypolyethaxyethanol,辛基茉氧基案乙氣乙醇），1 ng/tnL BSA(bovine serum alhumin,牛血清蛋白)。5.14电泳缓冲液：Tris54g，碰酸27.5B.0.5mol/LTE缓冲液（pH8.0)20mL,加蒸馏水至1000mL；使用时 10 倍稀释。
5.15漠化乙锭存液：用水配制成10mg/mL。5.16加样缓冲液：0.25%漠酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖水溶液5.17酶切缓冲液:10mmol/LTris-HCl (pH7.5),10mmol/LMgCl.50 mmol/t.NaCl0.1mg/mLBSA。6器设备
DNA热循环仪。
核蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3免费下载标准就来唯久标准网
恒温水浴锅。
离心机：离心力12000g。
6.5微量移液器0.5u10μL,10μ100#l,10μl~200μL,100μL1000μ)。6.6电泳仪。
6.7紫外检测仪。
6.8 pHi。
6.9天平，感量0.01 g。
试样选取与制备
按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均勾后待用。8检验步骤
8.1样品的总DNA提取
样品粒度100日时最少称取50mg60日最少称取100mg20目最少称取200mg称取样品于微量离心管中，加人600μL~800μL裂解液，65℃3h，期间不时振荡混12000g离心5min转移上清于洁净离心管中，加等体积酚，混匀，12000g离心5min，取.上清液，加等体积二氯甲烷+异成醇（24+1），混勺：12000g离心5mim，取上清液；加2倍体积冰预冷的无水乙醇，一20℃沉淀1h;12000g高心5min弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加人50叫L.TE，溶解沉淀。2
也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNAGB/T21106—2007
8.2DNA浓度和纯度的测定
取5mLIVA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260am和280nm处的吸光值A和As：DNA的液度按式(1)计算：C=AXNX 50/10c0
武中：
c-——DNA浓度，单位为微克每微升（u&/L）；A—--260nm处的吸光值；
N-—核酸稀释倍数,
当A/A2比值在1.7~1.9之间时，适宜丁PCR扩增。+++++++-++( 1)
8.3PCR扩增
50 μL 反应体系:10×PCR 缓泌液 5 μL、dNTP(5 Imol/L)1 μL、引物对(各 5 pmol/L)2 μl.. TaQDNA聚合酶2、模板NA100ng士50ng一般反应程序94℃额变性5min，91℃变性308，63℃退火308，72℃延伸30s,30个循环，72℃延伸 min。4C保存。
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空口对服。用已知含鹿源性成分的样品作阳性对照，用已知不含鹿源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。8.4PCR扩增产物电泳检测
取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入漠化乙锭忙存液至终浓度为0.μg/ml.，制胶。在电泳楷中加入电泳缓冲液，使液面刚没过胶。格5L-8μT，FCR扩增产物分别和适量加群缓冲液混合，点样。9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移罕凝胶中部。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
8.5限制性内切酶酶切及产物电检测如果PCR扩增产物克泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应反应体系(20μL）：AtuI海2T，酶切缓冲液2μL，加人PCR扩增产物至总体积20μL酶切在37℃下进行，30min。酶切完成后电泳.方法见8.4。9结果判断与表述
9.1PCR扩增产物电泳检测结果
性样品扩增产物为191bp序列参考附录A)。9.2限制性内切酶酶切电泳检测结果扩增产物酶划片段大小为145bp和49bp9.3结果表述
PCR产物为阳性，同时酶切结果正确者判为含有鹿源性成分，表述为检出鹿源性成分：PCR产物为阴化者判为个含有鹿源性成分，表述为米检出鹿源性成分。10检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193执行，
11弃物处理
捡测过程中的废弃物，收集后在获烧炉中楚烧处理，A
GB/T 21106-2007
C.elaphus(马鹿）
C.nippun（梅花鹿）
C.eldi(坡鹿）
C. unicolor(水鹿)
C,albirostris(白唇鹿)
C,elaphus
C. unicalor
附梁A
(资料性附录)
PCR产物测序结果
TCATCGCAGCACTCGCTATAGTACACTTACTCTTCCTTTCATCGCAGCACTTGCTATAGTACACTTACTCTTCCTTTCATCGCAGCACTTGCTATAGTACACTTACTTTTCCTTTCATCGCGGCACTCGCTATAGTACATTTACTCTTCCTTTCATCGCAGCACTTGCCATAGTACACTTACTCTTCCTTCACGAGACAGGATCTAATAACOCAACAGGAATCCATCAGACGCAGACAAAATCCCCTTCCACGAGACAGGATCCAACAACCUAACAGGAATCCATCGGACGCAGACAAAATCCOCTTCCACGAGACAGGAICCAAIAACCCAACAGGAATCCCAICAGACGCAGATAAAATTCCCTTCCACGAGACAGGATCCAATAACCCAACAGGAAICCCATCAGACGCAGATAAAATTFCCTTTCCACGAGACAGGATCCAATAAOAACAGGAATCCAICAAACGCAGACAAAATCCCTTCCatbnrustris
C.eluphus
C. nippon
C. unicalar
CACOCTTACTATACGATTAAAGATATCTTAGGTATCTTACTICTAATACTCTTCCFAAIACATCCTTACIACACCATTAAAGATATCTTAGGCAICTTACTTCTAGTACTCTTCCTAATACATCCTTACTATACTATTAAAGATATTTTAGGTATCCTACTCCTAATCCTCTTCTTAATACATCCTTACTATACCATTAAAGATATCTTAGGCATCTTACTTATAGTACTCTTCTTAATACAICIACTACACCATTAAAGATATCTTAGGCATCCTACTTCIGGTACTCTTCCTAATACalbirostris
C. elaphus
C, unirntnr
TTACTAGTATTATTCGCACCAGATCTGCTTGGAGACTTACTAGTATTATTCGCACCAGACCTGCTTGGAGATCTACTAGTACTATTCGCACCAGACCTGCTTGGAGACTTACTAGTATTATTCGCACCGGACCTGCTTGGAGACTTACTAGTATTATTCGCACCAGACCTACTTGGAGATC.atbirastris
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书号：155066-1-30294
GB/T 21106-2007
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