本标准规定了用荧光分光光度仪和高效液相色谱仪测定饲料中维生B2含量的两种方法。 本标准规定的方法1适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料、维生素混合饲料中的维生素B2的测定。待测液中维生素B2检测浓度为0.05μg/mL～0.2μg/mL。 本标准规定的方法2适用于维生素B2含量大于10mg/kg的复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素B2的测定。

ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T 14701—2002
代哲G13/147011993
分类号
【编号·3
标准确认章
饲料中维生素B?的测定
Determinalion of vitamin B, in feeds2002-10-31发布
中华人民正和国
国家质量蓝督检验检疫总房
2003-04-01实施
GB/T 14701—2002
本标准修订了G/T 14701一1993&饲料中维牛素B,的测定》,修订后的方法具有适用范用广,检测限低.高效、快捷、准确的特点：本标准参考了美国“化学分析协会第六十七期发表的《复合预混料中抗坏血酸，酰胺，吡哆醇，硫胺素及核黄素的液相色谱分析方法》和美回公职分析化学家协会（199C版）食物和维牛素制品中的核黄素炎光测定法》而制定。
本标准与GBT14701一1993的主要技术差异：标准规定『两种方法·方法1为荧光分光光度法保留GB/T14701一1993的全部内容，在范用中补充了复合预混合询料，将重复性允许差相对相差改为“相对偏差\：方法2为高效液相色谱法，确定了试样的提收条件，色谱条件及重复性要求，并确定广该法适用于维生素B2含量大于10mg/kg的复合预混合饲料及维生系预混合饲料。本标准规定了荧光分光光度法为仲裁法本标准由全国例料厂业标准化技术委员会提出井归口。本标准起草单位国家饲料质量监督检验中心（北京)本标准主要起草人：李兰、陈必芳。本标准所代替标准的历饮版本发布情况为：GB/T 14701—1993.1范围
饲料中维生素B,的测定
GB/T 14701—2002
本标准规定了用荧光分光光度仪和高效液相色谱仪测定饲料中继生素13.含量的两种方法。本标准规定的方法1适用于饲料原料、配个饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料，维生素预混合饲料中的维生素 B. 的测定。待测液中维生素 Be检谢浓度为 u / mL,~0, 2 μg/ nl.。本标准规定的方法2适用于维生索B，含量大于10)mg/kg复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素B的测定。
2规范性引用文件
下列文件中的条鼓通心
要标准的
修改单（不包括断误离离或修订片否可使用这些文件的最新版木。凡1行折卖验室用水为
GB/T 6682
G3/7 14699
蜀将采样方法
东报是度法（仲裁法）
3方法 1:荧光
3.1原理
森准、然
韩文件，尊
口期的
科试验
如黄素 C,H2nN,O.在 440
维牛素 B
光强度与核黄素逼成正比.用连二业标荧光强度的比值计擎样品核黄素的3.2试剂和溶满S
周试剂均为分
除非另有说喷
还原钧
凡是注口期能引用文件，其随后所有的励根据标雅达成协议的各方研究是版本适凰于本标准。
定浓度范国内其荧
生绿色荧光：
物质，由还原前后炎光强度之差与内的试剂，馏水
GB/r662中鼻级用水或相当纯度
的水。
3.2.1氢氰化钠溶
NaOH)-
氢氧化钠溶滤I=l.
盐酸液，c（HO
raol/L
ol/L。
盐酸溶波，r(HCI)
连二亚硫酸钠(Na,S保险防止吸潮高锰酸钾溶液.40g/L，
3.2.7冰乙酸。
3.2.8冰乙酸溶液c（CH,CO0H)=0.02mol/l.：将1.8ml.冰乙酸用水稀释至1000mL。3.2.9过氧化氢溶液，100 InL/L,现用现配。3. 2. 10维生素 PB,标溶液：
3.2. 10. 1 维生素 I3z储备液 1 :核黄素纯品(中国药典参照标准)于五氧化二磷十蝶器中 「燥 24 h,溶解于冰乙酸莽液（3.2.8)中,在蒸气浴1恒速搅动直至溶解，冷却后稀释至500mI.。盛人棕色瓶滴加甲禁避盖，球箱4C保存,保存期6个日。该溶液含0.1 n/ml.维牛素B：3.2.10-2维生素B忙备液Ⅱ：取维生素B，贮备液1（3.2.10.1)1CImL用冰乙酸溶液（3.2.8)稀释至1C0 ml-,盛于棕色瓶中滴加甲术覆盖,冰箱4℃保存,保存期3个月该溶液中含10 μg/nL维生素Bz。1
GB/T 147012002
3. 2. 10. 3维生素 B.标准工作液:取维生素B,贮备液 (3. 2. 1C).2)10 I1L,用水稀释至 100 InL,现用现配，该溶液巾含1/m维尘素B2：3.2.11荧光素标准溶液：
3.2.11.1荧光索贮备液：称取荧光素0.050g，用水稀释至1U(00ml..盛于棕色瓶中冰箱4C保存，该溶液中含50 g/ml.荧光素。
3-2. 11.2 荧光素标准工作液:取1 ml.荧光素贮备被(3. 2. 11. 1),用水定容至 1 000 ml. ,盛人棕色瓶中，低温保存：该溶液每毫升中含0.05μ荧光素。3.2.12浪甲酚绿pH指示剂
取溴甲酚绿 0.IR加氢氧化钠溶液(3.2.1)2.8 ml.使之溶解再加水稀释至200mL。变色范围pII3. 6~5. 2.
3.3仪器，设备
3.3.1荧光分光光度计。
3.3.2分析天平：感量0.0001g
3.3.3电热恒温水浴，
3.3.4具塞玻璃刻度试管，15mL。3.4试样的制备
按GB/T11699.1采样，选取具有代表性的样品至少500g、四分法缩减竿10I0g·磨碎，通过0.28 mrn孔筛，混勾，装人密闭穿器中，避光低保存备用。3.5分析步骤
注意：全部操作避光进行，
3.5.1称样
原料、配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料称取1多~2g·精确至0.001g：维生素预混合饲料称取C.25 g~~0. 5 g.精确至 0. 0 001 g,将试样置于 100 ml.容量瓶中。3.5.2试样溶液的制备
向盛试样的容量瓶巾加65mL盐酸溶被（3.2.3)：于沸水游中加热30min或于121C~~123℃15kg高压签中加热30min）.开始加热5min-10min时常据动容量瓶，以防试样结块。冷却至空温后，用氢氧化钠溶液(3. 2.2)调节 H 至 6. 0-~6. 5,然后立.即加盐酸溶液（3. 2. 43使P11值约为 4. 5(漠甲酚绿指标剂变为草绿色）。用水稀释卒刻度。通过中速无成滤纸过滤,弃去最切 5 ml,-1U ml,溶液，收架滤液于100 mL锥形瓶中1。取整份清，滴加稀盐酸检查蛋白质，如有沉淀生成，继续加氢氧化钠溶液，别烈振摇，使之沉淀完全。对高含量样品，取整份的遥清被·用水稀释至一笼体积使维生素R。约为0. 1 μg/mLe
3.5.3杂质氧化
于a,h,c一支15ml.刻度试管(3.3.4)中各吸人试样溶液(3.5.2)10mL,同时做平行.向试管a中翊入1 mL蒸馏水而试管b 巾加人1 mL 维素BT.作液(3. 2. 10. 3)。懿后各加入冰乏酸(3. 2.7）1 mL,旋摇泥勾后遥个加高锰酸钾游液(3.2.6)0.5mL,旋摇混勾，静置2min,再逐个加入过氧化氢溶液（3.2.9)0.5mL.旋据，使高钰酸钾颜色在10s内消褪。加盖摇动，使试管巾的气体逸尽。3.5.4测定
用荧光素(3.2.11.2)调整荧,光仪，使其稳定于一定数值、作为仪器工作的固定条件，调整激发波长440nm，测定试管8、b的荧光强度，试样溶液在仪器中受激发照射不超过10，在试管中加入20mg连二亚硫酸钠（3.2.5)，摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定其荧光强度作为空向。若溶液出现浑浊，不能读数。
3. 6结果计算
3.6.1计算公式：试样中维生素B，含虽按式1)计算：2
式中：
试样中维生素B:含量，单位为毫克每干克（mg/kg)：试管(试液加水)的荧光强度：
试管b(试液加标样)的荧光强度;试管c(试溉加连二亚硫酸钠)的荧光强度；加入维生素B,标样的量，单位为微克(g)；试获的初始体积，单位为毫《mL）；测定时分取试液的体积,单位为毫升（ml.)：试样质，单位为克（g）：
稀释倍数。
完二元值应在0.66~1.5.否则需调整样液的浓度。T,-T
3.6.2平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。3.7重复性
间一分析者对间一试样间时或快速连续进行两饮测定,所得结果的相对偏差：维生素B，含量/tmg/kg）
4方法2:高效液相色谱法
4.1原理
相对偏差/(%)
GB/T 14701—2002
试样中维生素B经酸性提取液在80C～100水浴煮沸提取后，经过滤离心后的试样溶液注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离，用紫外（或二极管矩阵检测器)检测.外标法计算维生素B，的含量，
4-2试剂和溶液
除特殊说明外,所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合GB/T6682中1级用水规定。
4.2.1 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)4.2.2庚烷磺酸钠(PICB,）,优纯。4.2.3冰乙酸，优级纯。
4.2.4三乙胺,色谱纯。
4.2.5甲醇.色谱纯。
4.2.6提取液：在已装入约 700 ml. 去离子水的 1 000 mL容量施中,加人 50 mgEDTA(4. 2.1)待全部溶解后,加人 25 mL 冰乙酸(4. 2. 3)5 mL三乙胺(4. 2. 4),用去离子水定容牟刻度摇勾。4.2.7流动相：在已装人约700ml去离子水的1000mI.容量瓶中,称入50 mg（精确至U.001g)EDTA(4.2.1)、1.1g(精确至 0.001g)庚烷磺酸钠(4.2.2),待全部溶解后加入25mL冰乙酸(4.2.3),5 mL=乙胺(4. 2. 4),用去离子水定穿至刻度匀用冰乙酸、三乙胺调节该溶液 pH 至 3. 40+心. 02,过0.45μml滤膜。取该游液860 mL与14U mL中醇(4.2.5)混合,超声脱气.待用。4.2.8维生素H标准溶液
4.2.8.1维生素B标准贮备液：准确称取维生素B，0.0100g于200ml.棕色容量瓶中，加1ml.冰乙3
GB/T 14701---2002
酸(4. 3)在沸水浴 80 C[00℃煮沸 30 min,待冷至室温后,用去离于水定容至刻度。此液浓度为50 g/ml,冰箱1℃避光保存,保存期 6个月，4. 2. 8.2 维生素 B, 标准工作液:准确吸取 5. 0 ml. 维生素 R,标准贮备液(1. 2. 8. 1)于 50 mL 棕色容量瓶中,用流动相(1.2.7)定容至刻度，该标准工作液浓度为 5/mL,待上机。4.3仪器、设备
4. 3. 1实验室常用玻璃器血。
4. 3.2pH计(带温控.精确至 0. 01)。4. 3.3 恒温水浴,0℃~-100℃
4. 3. 4针头过滤器,备0.45 m(或 0, 2 μm)滤膜，4.3.5高效液相色谱仪，带紫外或二极管矩牌检测器。4.4试样的制备
接GB/T 14699.1采样，逆腋有代表性的料样至少500g，分法缩减至 100 g,磨碎，全部通过0.28mm孔筛，混勾，装人密闭案器中，避光低温保存备用4.5分析步骤
注意：全部操作邀
4. 5. 1试样溶液的刺蛋,
称取维生素项混合离料0.25
0.001 g.于100
色容量瓶中
日提最液进一月
30 min，待冷却后,加真
14 mL甲醇
6倍10倍,联
4.5.2测定
150g·精罐至0.000Www.vV99.net
4. 5.2 1高效随辑色谱条件
im，内径3.9mm，不锈钢柱
色谱柱：长
固定相：NdG
kC粒度4u
流动相流递
温度：25℃
进样体积:1d
点的中
宝容至刻
复合预混合剂料1g～5g，精确至(1.2.6)弄
~100℃水浴中煮沸
馄勾、过滤。
维生童预混台饲料样液需
μm)滤膜.待上机
检测器；紫外
极管矩阵检，使用波长：多种维好联检为80 n品,单检维生素 B.为267nm
保留时:约10
4.5.2.2定量测定
按高效液相色谱仪说电仪器操精维错程注人维生素高，标准工作液（4.5.8.2)及试样溶滋（4.5.1)得到色谱峰面积的响游值,取标溶液蜂面积平均值定量计算标准工作液应在分析始术分翘进样，在样品多时,分析中间应插人标推工作液校正出峰时间。4.6结果计算
4.6. 1试样中维生素B,的含垦按式(2)计算：PX vXe xv.
式中：
试样中维生案B,的含量,单位为毫克每T克(mg/kg);试样质量，单位为克（g）
试样溶滴进样体积;单位为微升(μL);试样溶液峰面积值：
‘一标难溶液浓度,单位为微克每毫升（g/mL);V——标准溶液进样体积,单位为微升(μL)—标谁溶液峰面积平均值。
4.6.2平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数字3位。4.7重复性
同一分析者对同一试样同时两次平均测定结果的相对偏差维生素B,含量/(mg/kg)
>1. 00×10°
10-1.00×10
相对偏差/（%）
GB/T147012002
GB/T 14701-2002
中华人民共和国
国家标准
饲料中维生素B的测定
GB/T14701-2002
中国标准出版社出版
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邮政编码：100045
电话：6852331568517548
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斤冰880×123G1/16
印张3/4字数12下字
2003年3月第一版2003年3月第一次印别印数1 -1500
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