本标准规定了鲜河豚鱼中河豚毒素（tetrodotoxin，简写为TTX）的测定方法。 本标准适用于鲜河豚鱼中TTX的测定。

ICS 67.040
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.206—2007
鲜河豚鱼中河豚毒素的测定
Determination of tetrodotoxin in frcsh puffcrfish2007-10-29发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2008-04-01实施
中华人民共和
国家标准
鲜豚鱼中河豚毒素的测定
CH/T 5009. 206 2007
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本标推山中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标推主要起草人：计融、李风琴、王健伟、罗雪云、江涛、韩春卉、张靖。GB/T5009.206--2007
1范围
鲜河豚鱼中河豚毒素的测定
GB/T 5009.206—2007
本标准规定了鲜河豚鱼r河豚毒素（tetrodotoxin，简写为TTX)的测定方法。本标适用于鲜河豚鱼中7\IX的测定，本标准对 TTX 的检出限为 0.1 μg/L,相当丁样品中 1 g/kg的 T'I'X,标准曲线线性范围为5 μg/L~-500 μg/l,
2原理
样品中的河豚毒素经提取、脱脂后与定量的特异性酶标抗体反应，多余的游离酶标抗体则与酶标板内的包被抗原结合，加人底物后显，与桃推曲线比较来测定TTX含。3试剂
除TTX标准品外，实验所用的化学试剂均为分析纯。3.1抗河豚毒素单克隆抗体：杂交瘤技术生产并经纯化的抗TTX单克隆抗体。3. 2 牛血清白蛋白(BSA)。
3.3人I抗原：牛血清白蛋白-甲醛-河豚毒素连接物（3SA-HCHO-1'TX），一20℃保存，拎冻下燥后的人T抗原可空温或4保存。
3.4河豚毒素标雄品：纯度98为。3.5 Z.酸(CH,COOH).
3.6氢氧化钠（NaOHI)。
3.7 乙酸钠(CH.C(ONa)。
3.8 乙醛。
3. 9 N,N-二甲基中酰胺。
3.103,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB):4℃避光保存，3.11
辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗TTX单克降抗体：一20℃保存，冷冻-f燥后的酶标抗体可室温或1℃保存。
3.12碳酸钠（NaCO,）。
碳酸氢钠(NaHC(O),）
磷酸一氢钾(KH,FO)。
磷酸氢二钠(Naz HPO) 12H,O)。氯化钠(NaCI)。
氯化钾（KCI)
过氙化氢（H,0）:4避光保存。
纯水(MilliQ系统净化。
吐温 20(Twccn 20)
柠檬酸（CHOHO)，
98%浓硫酸(II, SO,）
GB/T 5009.206—2007
4溶液配制
4. 1 0. 2 mol/L pF 4. 0 乙酸盐缓冲液的制备4. 1. 1 0. 2 mol/1. Z.酸钠:16.4 g 乙酸钠加纯水溶解并定奔至 1 000 mL4. 1. 2 0. 2 trtol/1. 乙酸:11. 1 g 乙酸加[纯水溶解并定容至 1 000 ml.。4. 1. 30. 2 mol/L pII 4. 0 乙酸盐缓冲液:取 C. 2 1ual/I. 乙酸钠 2. 0 trl. 和 0. 2 mol/1. 乙酸 8. 0 ml. 混合而成，
4.20.01mul/LpH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)的制备分别称取 KH,F. 0.2 ,Na:HP0I2H,0 2. 9 g,NaC1 8. 0 g,KCl 0.2 g,抑纯水溶解并定容至1 000 ml.。
4. 3TTX标准储备溶液的制备
将河豚毒素标港品漆于0.2rnal/LpH 4.0乙酸盐缓冲液中,配成浓度为1.0 g/1.的标准储备液，密封后 4℃保存备用。
4.4TTX标准工作溶液的制备
将TTX标准储备液用0.01mo1/T.PB3S配制成浓度分别为5000.[00g/I,2500.(K)μg/L1 000. G0 μg/1.500. 00 Fg/L,250. 00 μg/L,100. 00 μg/L,50. 00 μg/L,25. G0 μg/L,10. 00 μg/1.5.00 μg/1、1.00 μg/L..0.50 μg/L.0.10 μg/L、0.05 μg/L的TIX标准工作济液,工作溶液现用现配，4.5包被缓冲液(pH 9.6的 0. 05 mol/L.碳酸盐缓冲液)的制备分别称取NazC1.59g,VaHCO2.93g.J纯水溶解并定容至1000 ml.。4.6封闭液的制备
2.0 g BSA加 PBS溶解并定容垒 1 000 mL,4.7洗液的制备
999. 5 mL PBS溶液中咖人 0. 5 mL的吐温-204.8抗体稀释液的制备
1.0 g BSA 加 PBS溶解并定容至 1 000 mL。4.9底物缓冲液的制备
4.9.10.1nol/1.柠檬酸漆液：21.01g柠檬酸（CH0,·H;O)加纯水溶解并定容至1000mL。4. 9.20.2 tnol/1. 磷酸氢二钠溶液:71.6 g Na,HP(),12H,0加纯水溶解并定容至 1 (I) mI。4.9.3底物缓冲液:将0.1mnl/1.柠檬酸液、0.2mol/L磷酸氢-钠溶液和纯水按照24. 3：25.7：5c的比例现用现配。
4.10底物溶液的制备
4. 10. 1TMB储存液:20G ng TMB溶于 20 mL N,N-=甲基甲酰胺中而成,4℃避光保存.4. 10.2底物溶液:将75 μL TMB诺存液,10 mL底物缓冲液和10 μL H,O.混合而成4.11终止液
2mol/l.的HSO,率液。取891.5ml98%的浓硫酸，缓缓加至盛有108.5mI.纯水的容量瓶中混匀。
4.120.1%乙酸溶液
1nI.乙酸加到09mT.纯水中。
4. 131mol/L Na0H 溶液
40名Na0H加纯水解升定幕室1000mL，5仪器
5.1组织浆器。
5.2温控磁力搅拌器。
5.3高速离心机。
5.4全波长光栅酶标仪或配有150nm滤光片的酶标仪，5.5可拆卸96孔酶标微孔板。
5.6恒温培养箱，
微量加样器及配套吸头（100μl、200μl.和1000μL)。5.8分析天平（精密度乃分之—）)。5.9
架盘药物天平。
125 ml.分液漏斗-，
100 mL. 量筒。
100I.烧杯。
5.13剪力。
5. 14溺斗。
[0 ml.吸样。
100 mL磨口具塞锥形瓶。
容量瓶（50ml.1000ml)。
3pH试纸。
5.19研钵。Vv99.net
6分析步骤
6.1样品采集及运输
GB/T 5009.206—2007
现场来集样品后立即1℃冷藏，并于当大运至实验空进行检验。如果路途遥远，可于当天进行冷冻，并应保存在冷冻状态中运输至检验实验室。6.2取样
对冷藏样品或冷冻后解冻的样品，用蒸馏水清洗鱼体表而的污物，滤纸吸干鱼体表面的水分后用剪刀将鱼体分解成肌肉、肝脏、肠道、皮肤、卵巢（雌为精囊)等部分，各部分红织分别用蒸馏水洗去血污滤纸吸于表面的水分后称重。
6.3样品提取
6.3.1将待测河豚组织用剪刀剪碎,加人 5倍体积0.1%的乙酸溶液（即1 名组织中加人 0.1%乙酸5 mL),用组织匀浆器磨战糊状，6.3.2取相当于5 多河豚组织的勾浆糊(25 mI.)了烧杯中,置温控磁力搅拌器上边加热边搅,达100℃时持续 10 min后取下,冷却至空溢后,8 000 r/min离心15 min,快速过滤于125 mL分液漏斗中。6.3. 3滤纸残渣用20 tL. 0.1%乙酸分次洗净.洗羧合并于原烧杯中,置温控磁,搅拌器 上边加热边揽拌，达100℃时持续 3min后取下，8000 r/min离心15mi过滤，滤液含并于6.3.2分液斗lf。6.3. 4在 6. 3. 2 分液漏斗的清液加人等体积乙醚握摇脱脂,静置分层后,放出水层至另 -分液漏斗中并以等体积乙醚再重复脱脂--饮，将水层放人100m[.锥形瓶中，减斥浓缩去除其中残存的乙醚后，将提收液移人150ml容量瓶中，
6. 3. 5 将 6. 3. 4 的提取液用 1 mol/L, NaOI 溶液调 pH 至 6. 5 ~7. 0,并用 PBS 定容至 50 mI.,立即用于检测（每笔升提取相当于（。1岛河豚组织样品）6,3.6当天不能检测的提取液经减压浓缩去除其中残存的乙醚后不用NaOH调pI,密封后一20℃以下羚冻保存，在检测前调节pH非定容至0n即检测。6.4测定
6.4.1包被酶标微孔板
用BSA-HCI0TFX人丁抗原包被标板：120L/孔，1静置12h。GB/T5009.2062007
6. 4.2抗体抗原反应
将辣根过氧化物酶标记的纯化TTX单克降抗体稀释后分别：a）与等体积不同浓度的河豚荐素标准溶液在2mL试管内混合后，4℃静置12h或37℃温育2h备用。此液用于制作TTX标准抑制曲线。b）与等体积样品提取液在2mL试管内混合后，4℃静置12h或37℃温育2h备用。此液用于测定样品中 TTX含量
6.4.3封闭
已包被的酶标板用PBS-T洗3次（每次浸泡 3min）后，加封闭液封闭,200μl/孔，置37'C温育2h.
6. 4. 4测定
封闭后的酶标板用PBST洗3×3min后，加抗原抗体反应液（在酶标板的适当孔位加抗体稀释液作为阴性对照）,100μT./孔,37℃温存2h,酶标板洗5×3min后，加新配制的底物溶液，100L/孔，37C温育10 min后，每孔加人 50 μL 2 mal/L的H.S0,终止显色反应，于波长450 nm处测定吸光度值。
6.5 结果计算
样品中 TTX的含量按式(I)计算：X -- m:VD/Vim
式中：
X--—样品中TTX的含晨，单位为微克每F克（ug/kg)；酶标板上测得的TTX的质量，单位为纳克(ng)，根据标准曲线按数值插入法求得：m1 —
V样品提最液的体积.单位为毫升（mL)；D（-样品提取液的稀倍数；
酶标板上每孔加入的样液体积，单位为毫升（ml)；m一-一样品质量，单位为克（g）)，(T
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