本标准规定了大豆种品种鉴定的实验方法。本标准适用于利用简单重复序列间区(ISSR)法对大豆种子品种鉴定的实验过程。

ICS65.020.01
中华人民共和国国家标准
GB/T19563--2004
大豆种子品种鉴定实验方法
简单重复序列间区法
Experimental identification method for variety of soybean seed--IssR2004-06-22 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2004-12-01实施
本标推的谢录 A为规范性附录。前
本标准由国质量监督检验检疫总扇提出。GB/T19563-2004
本标准起草单位：国家农业标准化蓝测与研究中心（龙江）、黑龙江省质量技术监督局。本标雅主要起草人：王庆贵、徐晶、姜星、李光宇、石绍业、郝兆军。GB/f19563-2004
尽前，我国农作物种子的鉴定多用种植鉴定、快速測定法（萃酚染色法、大豆种皮愈创本酚染色法、高梁种子氢氧化钾-漂白粉测定法，麦种子荧光测定法、小麦种学氢氧化钾测定法）、丙烯酰胺凝胶电泳法测定大麦、小麦种子纯度等。这些方法所露的检验周期较长，虽然电泳法所需时间短，但不具备分子水乎定的诸多优点。
随着分子生物学的发展，特别是20世纪90年代以来，分子生物学的相关技术已被广泛应用，其检测对象为I)NA 太分了一一生物的遗传基础，以 DNA为检测对象,具有许多其他检测水平所不备的优点：曾先，低供探测DNA标记的数量是无限的，这是同下酶技术所无法比拟的：其二，DNA分析技术不像其他技术那样随组织或发育除段丽异，植物体任何部位，任何时期提供的NA均可用于分析，其检测结果都感一样的第一，DNA分析不受环境影响，其变异只源年等使基四DA序列的变异+这种稳定性便于揭示品种间的遗传变异从而排除广环境变异所造成的表型变异。基于1述优点，INA分析技术是农、林、牧、渔等品种鉴定的先进方法。1范围
大豆种子品种鉴定实验方法，
简单重复序列间区法
本标推规定了大豆种子品种鉴定的实验方法。GB/T19563-—2004
本标准适用于利用简单重复序列间区(1SSR)法对大豆种子品种鉴定的实验过程2本语、定义和缩略语
2.1术语和定义
下列术语和定义适用于本标推。2. 1. 1
聚合酶链式反应polymerase chain reaction少至个拷贝的特定碱基顺序的DNA片断在体外花费几个小时即可扩增出数百万个分子的酶催化反应,即 DNA 合反应。
简单重序列间区inter-siruple sequence repeat是在PCR技术基础上发展起来的一种分子标记和检测方法，根据某个简单重复序列（微卫星位点）设计出一系列特异引物，通过P心尺反应扩增微卫星位点间隔的碱基顺序，以检测其扩增片段长度的多态性。
薇卫星 DNAmicrosatellite DNA是一类由几个核苷酸（一般为1全～5个）为重复单位的长达几卡至几百个核苷酸的串联重复序列。
核苷酸muelentide
是构成核酸的基本单元，由三部分组成；五碳糖、磷酸和环状的含氮碱基。2.1.5
引物primer
一条互杯结合在模板DNA链上的短的单链，提供3-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合戒模板 DNA 的互补链。
引物扩增多态性primer amplified polymorphism一对引物在两个或两个以上不同材料基因组DNA之间扩增，得到数目不间或长度不同的DNA片断，
2.2缩略语
下列缩略语适用于本标准。
ISSR简单复序列间区（Inter-SimpleSequenceRepeat）PCR聚合酶链式反应(Polytmerase Chain Reaction)DNA脱氧核糖核酸（DeoxyribonueleicAcid）GB/T195632004
RVA核糖核酸(Ribonucleic Acid)）OD光密度(OpticalDensity)
TBE三羟基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四Z酸二钠(TrisBoric-acidEDTA)3实验方法
3. 1原理
DNA是生物体的遗传基硼·携带所有的遗传物质，从DNA分子水平上进行鉴别是区分物种、品种甚至个体之闻差异最为有效的方法。利用PCR技术可将DVA片段在短时间内扩增几十甚至儿百万倍，从而达到可以检测的目的。ISSR方法是在PCR技术基础上发展起来的一种检测方法，是根据简单重复序列（微卫星位点）设计出一系列特异引物，包括双核苷酸、三核苷酸和四核苷酸等为重复单位的微卫星DNA片段（一般为20个基），通过PCR反应扩增微卫星位点及其间隔区，以检测其扩增片段的多态性。3.2环境条件
a温度.15℃～25℃;
b）湿度:析对湿度(RH)不人于 50%。3.3收器
a）PCR扩增仪：
b）紫外分光光度计；
高速台式离心机：转速不小于150001/min：d）多用电泳仪及水平式电泳槽：紫外透射仪：
微量移液器：规格为0.1ul~2.5μl.2μL~20μ.20μL~200μL,100mL1000μ;电子天平：分度值为（.0001g；g.
h）磁月加热搅拌器；
）凝胶成像系统：
超纯水系统：
k）灭菌锅；
酸度计：最大允许误差为士0.1pH；m）微波炉：
n）恒温水浴锅:最大允许误差为士1℃o）恒凝于燥箱：最大允许误差为十1℃。3.4试剂和耗材
3. 4. 1 试剂
TagDNA聚合酶：保存条件为一20℃士2℃；b）
10×Buffer：保存条件为一20℃士2℃；c)
四种脱氧核并酸（4×dNTP）:保存条件为一20℃士2℃Mg+：保存条件为一20℃土2℃；RNA酶（DNA酶），保存条件为一20℃土2℃e)
琼脂糖（agaruse）：
R）三羟甲基氨基甲烷(Tris):分子式为C.HuNO,h)
乙二胺四乙酸二钠(EDTANa·2HO)分子式为CHN,ONaz·2IIO漠酚蓝（bromphenolbluesodiumsalt)，分子式为CiH,Br.O,SNa）二甲苯青FF（xylenecyanoleFF）：分子式为CesH2rNzO,SN；2
k）8-羟基唑嘛（hydroxyquinoline)：分子式为C,H,No：1）十二烷基磺酸钠（SDS)：分子式为CHsO,SNa漠化乙链（EB）：分子式为CHaNBrm
异戊醇：分子式为CuOH
结晶酚（phenol)：分子式为CHO，保存条件为一20℃主2℃，0
三氟甲烷：分子式为CHCl纯度为分析纯p
酸（boricacid)：分子式为H，BO，纯度为分纯；q）
兼精（sucrase）：分子式为Cr?H22O，纯度为分析纯，)
s）无水乙醇：分子式为C.HOH,纯度为分析纯：）盐酸分子式为HCl,纯度为分析纯；氯化钠：分子式为Nal纯度为分析纯：）水：分子式为H，O。本实验所用水均为去离子水。3.4.2耗材
GB/T19563-—2004
离心管：规格为1.5mL，0.2mL。使用前需进行高压灭菌（按第A1章中规定的方法进行作）a)
研链：规格为直径7cm~10cmVv99.net
移液器暖头：规格为20uL、200μL和王000μL。使用菊需进行离压灭菌；e
d）容量瓶：规格为100mL、1000mL；e）烧杯，规格为100ml.
f）三角烧瓶：规格为250mlL
g）PE手套；
h）锡箍纸t
i）封口膜。
3.5实验程序
3. 5. 1 DNA 的提取
3.5.1.1取大豆种子半粒，放在1.5mL离心管中，加入1000μL匀浆缓冲液（按第A2章中规定的方法进行配制）浸泡4h，倒入研钵中充分研磨，将研磨产物倒人1.5ml.离心管中，取少量匀浆經冲液冲洗研体，一并倒入离心管中，离心（转速为40001/min)10min，将上清液移至新的1.5mL离心管中，弃沉淀。3.5.3.2加人与上清液等体积的炮和酚（按第A，3章中规定的方法进行配制），缓慢颠倒离心管20min，避免剧烈振满。
3.5.1.3离心（转速为8000x/min)10min，将上清液移至新的离心管中。3.5.1.4加人与上清液等体积的酚-三氯甲烷-异戊醇（体积比为24！231)，离心（转速为8000r/min）10min，将上清液移至新的离心管中。3.5.1.5加人与上消液等体积的三氟甲烷-异戊醇（体积比为23：1)，缓慢题倒10min，离心（转速为8000r/min）10min，取上清液至新的离心管中。3.5.1.6加人上清液二倍体积的冰冷乙醇，水乎璇转离心臀50圈~100，即可出现白色絮状DNA。3.5.1.7将离心管叠于一20℃冰箱中30min，取出后离心（转速为8000z/min)10min，形成白色沉淀。3.5.1.8倒掉离心管中的液体，加人1.ml75%乙醇，离心（转速为15000/min）5mim，倒掉乙醇，倒置在于净的吸水纸.上，吸干被体。3.5.1.9将离心管置于恒温千燥箱（40℃~50℃）中20min或量于通风处40min，使乙醇挥发。3.5.1.10加人100μLTE缓冲液（按第A.4章中规定的方法进行配制）和RNA酶2L（按第A.5章中规定的方法进行配制）水浴（55℃士2℃)12h，使DNA沉淀充分溶解，4℃冰箱中保存。GB/T19563—2004
3.5.2DNA浓度的检測
3.5.2.1紫外吸收检测
DNA分子中的睡呤环和嘧啶环能够吸收紫外光。DNA的紫外吸收商峰在波长260nm处，蛋质的紫外吸收高峰在波长280nm处。取3.5.1中提取的DNA溶液5uL，加水995μ.，放人比色杯中，用策外分光光度计检测，记下260 nm和280 nm下的OD值,计算出 DNA的浓度以及OD和ODga的比值。DNA的OF26/OD2最好在1.8左右，1.5以上也可用于ISSR-PCR分析，者比值太小应重复3.5.1.2~3.5.1.10步骤继续抽提。DNA浓度按公式(I)计算：
D=50X1000XDXs
式中，
D—DNA的浓度，单位为纳克每微升3.5.2.2凝胶电泳检测
将制备好的浓度为0.7%的琼脂糖凝胶（按第人.6章中规定的方法进行配制）放入电泳槽中，使点样孔处于电源负极端，加人恰好没过胶面1mm深的足量电泳缓冲液（0.5×TBE)（按A.6.3中规定的方法进行配制）。取DNA溶液10μL和凝胶加样缓冲液（按第A7章中规定的方法进行配制）2tI，在封口膜上用微量移液器上下吸打海匀，人到点样孔中（注意避免出现气泡）。打开电源，将电压控制在5V/cm，电泳1h，取出凝胶，放在紫外透射仪上观察。若DNA质量好、分子量高（>50kb）且无降解，在点样孔附近呈现一条致密亮带，若DNA部分降解，则呈连续分布状态，若严重降解，则看不到大片段DNA，只能在远离加样孔的地方看到RNA。3.5.3ISSR扩增
3.5.3.1反应成分
25μL反应体系中，含有1×Buffer,1.5mnol/LMg+200umol/LdNTP，1UTagDNA聚合酶，1μumol/L引物.100ng模板DNA，加水至25μl（各反应成分的配制按第A.8章中规定的方法进行）。按上述比例将反应液依次加入0.2mL.离心管中，放人PCR仪中，进行PCR循环。3.5.3.2循环过程
循环过程如图1所：
94℃预变性丫min
94℃变性30%
48℃退火45 s
T延伸S
72℃延神7 mim
4种却
45个循环
图PCR反成循环过程茶意图
3.5.3.3电泳检测
将制备好的浓度为2%的琼脂糖凝胶（按第A.6章中规定的方法进行配制)放人电泳檐中，使点样孔处于电源负极端。取PCR扩增产物10L和凝胶加样缓冲液（按第A，7章中规定的方法进行配制）2ul在封口膜上用微量移液器上下吸打混勾，加人到点样孔中。打开电源，将电压控制在3V/cm，电泳4h，切断电源，取出凝胶，在凝胶成像上扫描。3. 5. 3. 4鉴定
将待测品种的凝胶成像结果与该品种原种的标准谱带相比较，从而鉴定出该品种的真实性。A1高压灭菌的操作方法
附录A
（规范性附录）
灭菌方法及缓冲液和主要试剂的配制GB/T19563—2004
将欲灭菌的离心管放人烧杯中，用锡箱纸封，移被器吸头装在吸头盘内：配好的试剂装人试剂瓶中，盖好盖，放入灭菌锅中。首先将压力升至1Pa，放气，再将压力重新升至1Pa，开始计时，20min后，将电源关闭。待压力为零时，取出离心管，吸头及试剂瓶，待用。A. 2匀浆缓种液的配制
取1mol/LTrisCl(p8.0)200mL.0.5mol/LEDIA(pH8.U)50mL0.5gSDS,加水至100mL。使用前应保证SDS充分溶解，若出现结晶，应放在50C水浴中辫解10min。A. 2. 11 mo/ Tris ·Cl(pH8. 0),称取 12. 11 g Tris,溶于 80 mL水中,用浓 HCl 调节溶薇的 pH 值室8.0.加水定容至100 mL,高压灭菌。A. 2.2 0. 5 mol/L EDTA(pH8. 0).称取 18. 61 g EDTA Na * 2H,O,溶于 80 mL 水中,在磁力加热搅摔器上剧烈搅拌,用Na0H(约需2g左右)调节溶液的pH值至8.0,加水定容至100mL,高压灭菡。A.3饱和酚的制备
饱和酚的制备宜在通风橱或通风良好的条件下进行。A.3.1将案温下的酚置于60℃水浴中融化，然后倒人蒸缩器中加热，在180℃左右搜集液体。经重蒸的酚分装存于一20冰箱中备用，A.3.2将重蒸酚 60℃水浴中融化后加人8-羟基琳达到然浓度0.1%，加人等体秘 0.5 加o1/LTris·ClpH8.0)落液，用磁力加热搅拌器混匀后静止一段时间，移出上层水相，重复此过程，直到酚相的pH值大于7.8时，即为饱和酚溶液，装人棕色瓶中，4℃球箱中贮存。A,4TE线冲港的配制
取 1 mol/L Tris Cl(pH7. 6)1 mL,0. 5 mol/L EDTA(pH8. 0)0.2 mL,奶水至 100 mLA. 4. 11 moi/L Tris ·Cl(pH7. 6):称取 12. 11 g Tris,溶于 80 mL 水中,用浓 HCl 调节溶液的 pH 值至 7.6,加水定容至 100 mL,高压灭菌。A, 4.20.5 mol/L EDTA(pH8.0).周 A.2.2。A.5RNA酶(10mg/mL)的配制
称取 RNA酶 1 mg,溶于100 μL TE缓冲滋中,水浴(70C)10 min绥慢冷却至室温。A, 6琼脂糖凝胶的配制
配制浓度为 0. 7%(或 2%>的琼脂糖凝胶需称取琼脂糖 0. 7 g(或 2 g)置于 200 mL 三角瓶中,溶于100mI.0.5×TBE中，在微波炉中溶化室溶液透明，冷却至50℃~60℃，加人溴化乙锭（10mg/mL），调至终浓度为0.5Hg/ml.混勾后将疑胶倒入已封口并放好梳子（距底板1.0mm左右）的载胶板上凝胶厚度在3mm~5 mm为宜,待凝胶完全凝固后放人电泳槽中备用。A,6.1 溴化乙链(EB)贮液(10 mg/mL):称取 1 g漠化乙锭,溶于 100 ml.水中，用磁力加热搅拌器搅拌数小时以确保其完全溶解，移室棕色瓶中，4℃冰箱中保存。GB/T 195632004
A, 6.2 5X TBE,称取 54 Tris,溶于 800 mL. 水中,加人 20 mL 0. 5 m01/L EDTA(pH8. 0)种 27. 5 g确酸，定穿至1000m高压灭菌，忙存于室温。A,6.30.5×TBE:称取 5×TBE 100 mL,加水定容至 1 000 mL,备用。A.7凝胶加样缓冲渣
0.25%酚蓝,0.25%二甲苯青FF、40%(质量浓度)蔗糖水溶液。A, 日反应体系中各反应成分的配制A, 8. 11U TaqDNA 聚合酶
25 μL反应体系中需加人 TagDNA 聚合降体积按公式(A1)计算：V
式中，
-TaqDNA桑合醇的体积,单位为微升(μI,);DTaqDNA 桑食醇的浓度,单位为单位每微升(U/μL) 。A. 8. 21. 5 mmol/L Mg +
25μL反应体系中需期人Mg*体积按公式(A.2)计算：V=1.5×25
式中：
V-Mg2+的体积,单位为微升(μL）D-Mg+的浓斑,单位为塞摩尔每升(mmol/L)。A, 8. 310 μmol/L 引物
首先将引物离心，然后加水稀释。加水体积按公式(A.3)计算,放在一20C冰箱中保存，每次使用前用水释三倍,终浓度即为 10 Amol/LV
其中公式(A.3)中M的计算按公式(A，4)进行：.*( A.3)
M nA X 313. 22 + nG X 329, 22 + nC X 289, 19 + nT X 304. 19 - 61, 97 -**-+( A, 4 )式中，
一加水体积,单位为微升(tL)
M一-引物分子量，单位为克每毫升（g/mI.）：-碱基数1
A腺源呤（adenine)
一鸟漂呤（guanine);
C——胞嘧瞻(cytosine);
胸腺嘧啶（thymine)。
参考文献
GB/F 19563—2004
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