本标准规定了蜂王浆中十八种磺胺类药物（见表２）残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定。

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22947-—2008
蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法
Determination of 18 sulfonamides residues in royal jelly-LC-MS-MSmethod
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标准的附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人：贾光群、曹彦忠、张进杰、王占英、石玉秋、姚智慧、庞国芳。GB/T22947—2008
1范围
蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法
GB/T22947—2008
本标准规定了蜂王浆中十八种磺胺类药物（见表2)残留量液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定。本标准的方法检出限均为5.0μg/kg。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T6379.12004,ISO5725-1:1994,1DT)GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2:1994，IDT）GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
蜂王浆中磺胺类药物残留用去离子水提取，三氯乙酸沉淀蛋白，离心后，上清液经OasisMCX离子交换柱\或相当的固相萃取柱净化，用氨水-甲醇溶液（1十19）洗脱并蒸于，残渣用乙腊-0.01mol/L乙酸铵溶液溶解，过0.2um滤膜后，样品溶液供液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。4试剂和材料
4.1水.GB/T6682，-级。
4.2甲醇：色谱纯。
4.3乙睛：色谱纯。
4.4乙酸铵：优级纯。
4.5三氯乙酸：优级纯。
4.6甲酸：优级纯。
氨水：分析纯。
0.01mol/L乙酸铵溶液：称取0.77g乙酸铵（4.4)溶于1000mL水中。4.8
4.92%甲酸溶液：吸取2mL甲酸（4.6)用水稀释至100mL。4.10
50%三氯乙酸溶液：称取20g三氯乙酸（4.5）溶于20mL水中。4.11
氨水-甲醇溶液（1十19）：吸取5mL氨水（4.7）与95mL甲醇（4.2）混合均匀。4.12
均匀。
乙腈-0.01mol/L乙酸铵溶液（3+22）：量取12mL乙腈（4.3）与88mL乙酸铵溶液（4.8）混合1）OasisMCX离子交换柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。1
GB/T22947—2008
4.13十八种磺胺类药物标准物质：磺胺嘧啶（CAS：68-35-9）、磺胺噻唑（CAS：72-14-0）、磺胺吡啶（CAS:144-83-2）、磺胺甲基嘧啶（CAS：127-79-7）、磺胺间甲氧嘧啶（CAS：1220-83-3）、磺胺甲噻二唑（CAS：144-82-1）、磺胺二甲嘧啶（CAS：57-68-1）、磺胺甲氧哒嗪（CAS：80-35-3）、磺胺对甲氧嘧啶（CAS:651-06-9）、磺胺氯哒嗪（CAS：80-32-0）、磺胺甲基异嗯唑（CAS：723-46-6）、磺胺邻二甲氧嘧啶（CAS：2447-57-6）、磺胺二甲异嚏唑（CAS：127-69-5）、磺胺苯酰（CAS：127-71-9）、磺胺氯吡嗪（CAS：102-65-8）、磺胺苯吡唑（CAS：526-08-9）、磺胺间二甲氧嘧啶（CAS：1037-50-9）、磺胺喹嗯啉（CAS：5940-5）。纯度≥99%。
4.140.1mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的每种磺胺标准物质（4.13），用甲醇分别配成0.1mg/mL的标准储备溶液。该溶液在4℃保存。4.155.0μg/mL磺胺混合标准工作溶液：分别吸取各标准储备溶液（4.14)0.5mL移至10mL容量瓶中，用甲醇稀释成5.0μg/mL混合标准工作溶液。该溶液在4℃保存。4.16磺胺内标物质：磺胺甲基异嗯唑-D4、磺胺嘧啶-D4、磺胺噻唑-D4。纯度≥99%。4.170.1mg/mL磺胺甲基异唑-D4、磺胺嘧啶-D4、磺胺噻唑-D4内标储备溶液：称取适量磺胺甲基异嗯唑-D4、磺胺嘧啶-D4、磺胺噻唑-D4标准物质（4.16）,用甲醇分别配成0.1mg/mL的内标储备溶液。该溶液在4℃保存。
4.18混合内标工作溶液：分别吸取磺胺甲基异嗯唑-D4、磺胺嘧啶-D4、磺胺噻唑-D4储备溶液（4.17）各0.5mL移至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该溶液在4℃保存。4.19基质标准工作溶液：吸取不同体积标准工作溶液（4.15）和20μL混合内标工作溶液（4.18），用空白样品提取液配成5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL不同浓度的基质标准工作溶液。当天配制。
4.20OasisMCX柱或相当者：150mg，6mL。用前依次用5mL甲醇（4.2)和10mL水处理。保持柱体湿润。
4.21滤膜：0.2μm
5仪器
5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。5.3具塞的聚丙烯试管：50mL。
5.4振荡器。
5.5液体混匀器。
5.6固相萃取装置。
5.7玻璃贮液器：50mL。
5.8氮气浓缩仪。
5.9浓缩管：10mL
6试样制备与保存
6.1试样的制备
对于冷冻的实验室样品，待其解冻后将其搅拌均。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记。
6.2试样的保存
将试样于一18℃冷冻保存。
7测定步骤
7.1提取
GB/T22947—2008
称取2g试样，精确至0.01g。置于50mL具塞的聚丙烯试管（5.3)中，加入20μL内标工作溶液（4.18），然后加入20mL水，于液体混勺器（5.5）上快速混勾1min，再置于振荡器（5.4）上振荡提取10min，加人0.5mL三氯乙酸溶液（4.10），快速摇动30s，以3000r/min离心5min，移取上清液至三角瓶中，再向残渣中加人15mL水，重复上述步骤，合并上清液，待净化。7.2净化此内容来自唯久标准下载网
将塞有玻璃棉的玻璃贮液器（5.7)连到OasisMCX柱（4.20）上，把上清液（7.1)倒人玻璃贮液器中，调节流速小于3mL/min，待样液完全流出后，依次用5mL甲酸溶液（4.9）和5mL甲醇（4.2）洗柱，弃去全部流出液。最后用5mL氨水-甲醇溶液（4.11)洗脱，收集洗脱液于10mL浓缩管（5.9)中。用氮气浓缩仪（5.8）于50℃吹干。准确加入1.0mL乙腈-0.01mol/L乙酸铵溶液（4.12)溶解残渣，样液过0.2 μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液。7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：AtlantisCis，3μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）
流动相：A：乙睛，B：0.1%甲酸水溶液，C.甲醇。梯度洗脱条件见表1；流速：0.2mL/min；
柱温：35℃；
进样量：20μL。
表1流动相梯度表
时间/min
质谱参考条件
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描：
检测方式：多反应监测；
电喷雾电压：5500V；
雾化气压力：0.076MPa；
气帘气压力：0.069MPa；
辅助气流速：6L/min；
离子源温度：350℃；
定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表2。c/%
GB/T22947—2008
表2十八种磺胺类药物的定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压化合物中文名称
磺胺嘧啶
磺胺噻唑
磺胺吡啶
磺胺甲基嘧啶
磺胺间甲氧嘧啶
磺胺甲噻二唑
磺胺二甲嘧啶
磺胺甲氧哒嗪
磺胺对甲氧嘧啶
磺胺氯哒嗪
磺胺甲基异嘎唑
磺胺邻二甲氧嘧啶
磺胺二甲异嗯唑
磺胺苯酰
磺胺氯吡嗪
磺胺苯吡唑
磺胺间二甲氧嘧啶
磺胺喹嗯啉
化合物英文名称
sulfadiazine
sulfathiazole
sulfapyridine
sulfamethoxypyridazine
sulfamonomethoxine
sulfamethizole
sulfamethazine
sulfamethoxypyridazine
sulfameter
sulfachloropyridazine
sulfamethoxazole
sulfadoxine
sulfisoxazole
sulfabenzamide
sulfachloropyrazine
sulfaphenazole
sulfadimethoxine
sulfaquinoxaline
定性离子对
251/156
251/185
256/156
256/107
250/156
250/184
265/156
265/172
281/156
281/215
271/156
271/107
279/156
279/204
281/156
281/215
281/156
281/215
285/156
285/108
254/156
254/147
311/156
311/108
268/156
268/113
277/156
277/108
285/156
285/108
315/156
315/160
311/156
311/218
301/156
301/208
定量离子对
251/156
256/156
250/156
265/156
281/156
271/156
279/156
281/156
281/156
285/156
254/156
311/156
268/156
277/156
285/156
315/156
311/156
301/156
碰撞气能量/
去簇电压/
7.4液相色谱-串联质谱测定
7.4.1定性测定
GB/T22947—2008
将各被测组分分别选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度K
允许最大偏差
7.4.2定量测定
2010以%表示
K≤10
用基质标准工作溶液（4.19)分别进样，以各标准峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，以各标准工作溶液浓度与内标溶液浓度的比值为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中十八种磺胺类药物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，十八种磺胺类药物的参考保留时间见表4。十八种磺胺类药物的标准多反应监测（MRM)色谱图参见附录A中的图A.1。
本方法中十八种磺胺类药物添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中的表B.1。表4十八种磺胺类药物参考保留时间化合物名称
磺胺嘧啶
磺胺噻唑
磺胺吡啶
磺胺甲基嘧啶
磺胺间甲氧嘧啶
磺胺甲噻二唑
磺胺二甲嘧啶
磺胺甲氧哒嗪
磺胺对甲氧嘧啶
7.5平行试验
保留时间/min
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7.6空白试验
除不称取样品外，均按上述步骤进行。8结果计算
化合物名称
磺胺氟哒嗪
磺胺甲基异嘧唑
磺胺邻二甲氧嘧啶
磺胺二甲异嗯唑
磺胺苯酰
磺胺氯吡嗪
磺胺苯吡唑
磺胺间二甲氧嘧啶
磺胺唑嗯啉
蜂王浆中十八种磺胺类药物残留量的测定结果按式(1)计算。a、
式中：
试样中被测物残留量，单位为微克每千克（ug/kg)；1000
基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；C
试样溶液中被测物的色谱峰面积；A
基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；保留时间/min
（1）
GB/T22947—2008
试样溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；基质标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL)；基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积；试样溶液中内标物的色谱峰面积；样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；试样溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。计算结果应扣除空白值
精密度
一般规定
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，蜂王浆中十八种磺胺类药物添加浓度范围及重复性方程见表5。表5添加浓度范围及重复性和再限性方程化合物名称
磺胺嘧啶
磺胺噻唑
磺胺吡啶
磺胺甲基嘧啶
磺胺间甲氧嘧啶
磺胺甲噬二唑
磺胺二甲嘧啶
磺胺甲氧哒嗪
磺胺对甲氧嘧啶
磺胺氮哒嗪
磺胺甲基异嗯唑
磺胺邻二甲氧嘧啶
磺胺二甲异嗯唑
磺胺苯酰
磺胺氯吡嗪
磺胺苯吡唑
磺胺间二甲氧嘧啶
磺胺喹唔啉
添加浓度范围
注：m为两次测定值的平均值。
重复性限r
lg r=1. 319 5 Ig m-1. 566 1
Ig r=1. 428 1 lg m-1. 757 3
lgr=0.9337lgm1.0499
lg r=1. 278 7 lg m1. 485 2
lgr=1.3061lgm-1.6252
lgr=1.0851lgm-1.426g
Igr=0.9582lgm-1.1850
lgr=1.3423lgm-1.2995
lgr=0.8920lgm-1.0160
Igr=1.4154lgm-1.4363
lgr=0.8369lgm
lgr=1.0991lgm1.1818
lgr=1.1470lgm
lgr=1.0569lgm1.2776
lgr=0.8449lgm-1.1208
Igr=1.1813lgm
lg r=1. 047 7 lgm—1. 323 2
lgr=0.9185lgm-1.0654
单位为微克每千克
再现性限R
lg r=1. 261 3 lg m-1. 287 2
lgr=1. 3766 lgm-1. 335 7
lgr=1.1830lgm-0.9735
lg r=1. 205 0 lg m-1. 141 9
Igr=1.1186lgm-1.0905
Ig r=1. 177 4 lgm-1.162 7
Igr=1.0745lgm-1.0287
lgr=1.3141lgm-0.9663
lgr=0.9875lgm-0.9051
lgr=1.3900lgm-1.1803
lgr=1.0966lgm-1.1560
lgr=1.08571gm-0.9053
lgr=1.4686lgm-1.3792
lgr=1.4528lgm-1.4866
Igr=0.9769lgm-0.8218
Igr=1.3630lgm
lgr=1.3350lgm-1.3173
lgr=1.3522lgm-1.1577
如果差值超过重复性限「，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。9.3
再现性
在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，蜂王浆中十八种磺胺类药物添加浓度范围及再现性方程见表5。6
附录A
（资料性附录）
标准物质多反应监测（MRM）色谱图十八种磺胺类药物标准物质多反应监测（MRM)色谱图见图A.1。响2.2e4
购3.0e41
电1.6e41
磺胺嘧啶
101214t/min
磺胺甲基嘧啶
2468101214/min
磺胺二甲嘧啶
468101214/mim
磺胺氯哒嗪
468101214/min
磺胺噬唑
2468101214/min
磺胺间甲氧嘧啶
68101214／/min
磺胺甲氧哒嗪
101214／/min
磺胺甲基异呕唑
2468101214/min
GB/T22947-—2008
磺胺吡啶
468101214/min
磺胺甲噻二唑
101214/mir
磺胺对甲氧嘧啶
2468101214t/min
磺胺邻二甲氧嘧啶
2468101214/min
图A，1十八种磺胺类药物多反应监测（MRM)色谱图7
GB/T22947—2008
磺胺二甲异嘧唑
值4.5e4号
3101214t/min
磺胺苯吡唑
1214t/mir
磺胺苯酰
101214/min
磺胺间二甲氧嘧啶
1214/min
图A.1（续）
磺胺氯吡嗪
68101214/min
磺胺唑哪嘛
1214t/min
附录B
（资料性附录）
本方法中十八种磺胺类药物添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B.1。GB/T22947—2008
表B.1十八种磺胺类药物添加浓度及其平均回收率的试验数据化合物名称
磺胺嘧啶
磺胺噻唑
磺胺吡啶
磺胺甲基嘧啶
磺胺间甲氧嘧啶
磺胺甲噻二唑
磺胺二甲嘧啶
磺胺甲氧哒嗪
添加浓度/(μg/kg)）
平均回收率/%
GB/T22947—2008
化合物名称
磺胺对甲氧嘧啶
磺胺氯哒嗪
磺胺甲基异嗯唑
磺胺邻二甲氧嘧啶
磺胺二甲异嗯唑
磺胺苯酰
磺胺氧吡嗪
磺胺苯吡唑
磺胺间二甲氧嘧啶
磺胺喹喽啉
表B.1（续）
添加浓度/（μg/kg）
平均回收率/%
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