本标准规定了饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检验方法。 本标准规定了饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测和计数。

ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T26428—2010
饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测Method for determination of Bacillus subtilis in feeds2011-01-14 发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会國
2011-07-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由全国伺料工业标准化技术委员会(SAC/TC 76)归口。本标准起草单位：广东省微生物分析检测中心本标准主要起草人：朱红惠、孙晓棠、羊宋贞，陈远良、张鲜姣。GB/T26428—2010
1范围
饲用微生物制剂中枯草芽抱杆菌的检测本标推规定了饲用微生物制剂中枯草芽抱杆菌的检验方法。本标推适用于饲用微生物制剂中枯草芽抱杆菌的检测和计数。2规范性引用文件
GB/T 26428—2010
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 14699.1衡料采样(GB/T 14699.1—2005,ISO 6497:2002,IDT)GB/T20195动物饲料试样的制备(GB/T20195—2006,ISO6198:1998,IDT)3稀释液、培养基及试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水采用蒸馏水或去离子水，或相当纯度的水。
3、10.85 %灭菌生理盐水。
3.2营养琼脂(NA)培养基：参见附录A中的A.13.3革兰氏染色液;参见附录 A中的 A.23.47%氯化钠生长培养基;参见附录A中的A.33. 5 V-P测定培养基和试剂:参见附录 A 中的 A. 4。3.6
硝酸盐还原培养基和试剂：参见附录A中A.53.7 D-甘露醇发酵培养基;参见附录 A 中的 A. 63. 8丙酸盐利用培养基;参见附录 A 中的 A. 74设备和玻璃器血
除常用微生物实验室设备外，其他设备和玻璃器血如下。4.1恒温培养箱：37℃士1℃
4.2pH计：精度到士0.1个单位。4.3玻璃或塑料培养血。
4.4刻度吸管：标记容量为1mL和10mL,最小刻度分别为0.1mL和0.5mL4.5玻璃或塑料涂布棒。
4.6显微镜：1000倍。
5采样
实验室样品真实、具有代表性。采样工具，如铲子，匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是灭菌的。1
GB/T26428—2010
样品送到微生物检验室应越快越好。来样数量和方式按照GB/T14699.1执行。6试样的制备
按照GB/T20195进行试样的制备，样品制备后应尽快检验。7操作步骤
7.1检样制备、初始悬液和十倍稀释以无菌操作称取试样25 g（mL),加人225ml 0.85%灭菌生理盐水,均质 1min～2 min,制成1 10的初始悬浮液。吸取 1 ：10 的初始悬浮液 1 mL,加人 9 mL 0. 85 %灭菌生理盐水,经充分混匀后制成1100的稀释羧。根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释。7.2接种和培养
选择2个～3个适宜的稀释度，水浴80℃士1℃维持10min，用无菌移液臀分别吸取0.1mL，接种到两个营养琼脂平板（3.2)上。使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平血边缘。每个乎血用·支无菌涂布。涂布好的平血盖好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。翻转上述平Ⅲ置 37℃±1℃培养箱中培养 48 h士2h。7.3菌落计数及筛选
培养后,选取菌落数在30个～300个之间的平板计数。若平板中有较人片状菌落生长时，则不宜采用;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勾，即可计算半个平板后乘以2以代表全血菌落数。典型枯草芽孢杆菌菌落表面粗糙，不透明，不闪光，边缘扩张，圆形或蔓延成波浪形、不规则形，灰白色或微黄色。然后从中选出5个特征菌落进行确证试验。7.4确证试验
7.4.1概述
目前商业上的生化鉴定试剂盒或生化鉴定管，如果采用的培养基与本标准确证试验所用的培养基一致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化鉴定管进行该项确证试验。7.4.2菌种制备
自平板上挑取单菌落,划线转接培养于营养琼脂平板上,37℃土1℃培养 48 h士2 h。从每一平板中选至少1个好分离的特征菌落，转接保存，进行确证试验。7.4.3形态观察
将挑选纯化的菌落做革兰氏染色（3.3)镜检。枯草芽孢杆菌细胞应为杆状，有芽孢，芽孢圆形，中生或近中生，芽抱囊不明显腰大。7.4.4生理生化确证试验
将挑选纯化的菌落进行7%氯化钠生长（3.4）.V-P测定（3.5）,硝酸盐还原（3.6)、D-甘露醇发酵(3.7)和内酸载利用(3.8)试验。2
7.4.5确证结果
GB/T 26428—2010
枯草芽孢杆菌菌落表面粗糙，不透明，灰白色或微黄色，细胞杆状，有芽孢，芽孢椭圆形中生或近中生,芽孢囊不明显膨大，在7%氯化钠中生长，V-P测定阳性，硝酸盐还原阳性，能从D-甘露醇产酸,不利用丙酸盐者可判为枯草芽孢托菌。枯草芽孢杆菌与类似芽孢杆菌的鉴别特征见表1。表！枯草芽孢杆菌与其他类似芽孢杆菌的鉴别特征枯草芽孢
厌氧生长
硝酸盐还原
淀粉水解
明胶液化
利丙酸盐
用柠蕊酸盐
D-木糖
L-阿拉伯糖
D-甘露醇
7%氟化钠生长
pHS5.?生长
地衣芽孢
B. subtilinB lichemiformis
蜡样芽孢
避结芽孢
B.coagutans
注：十;阳性；一：阴;d:部分菌株为阳性;ND:未测定。结果计算与报告
8.1计算每块板上枯草芽孢杆菌菌落数坚强芽孢
计数块平板上的粘草芽抱杆菌菌落数卫，便用式(1)计算：xc
式中：
计数每块平板.L的枯草芽孢杆菌菌落数；b
挑取后经证实为枯章芽孢杆菌的菌落数；A——挑取平板上用于验证的菌落数;C-
-平板上的所有特征菌落数。
最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。示例：
迟缓芽孢
巨大芽孢
B. megateriu
短小芽袍
B. pumilus
若某板上长有78个典型菌落，从中选出做确证实验的5个菌中有4个证实为枯草芽孢杆菌，则：告 × 78 = 62. 4
按照GB/T8170数值修约规则得a为 62。3
GB/T 26428—2010
8.2样品中枯草芽孢杆菌数的计算方法与报告选择两个连续稀释度平板（每个稀释度至少有一一块平板，其上经确证后的枯草芽孢杆菌菌数介于30～300之间),通过式(2)计算，即为1 mL或1样品中的枯草芽孢杆菌数N：a
V(n+o.In)d
式中：
N样品中枯草芽孢杆菌菌数；
a所有平板经确证后的枯草芽孢杆菌菌数的总和；V—平板的接种体积,单位为毫升(mL)；第一个稀释度的平板数；
n2一第二个稀释度的平板数；
第一个稀释度的稀释因子（未经稀释的液体样品的α值为1)。{2)
按照GB/T 8170数值修约规则将计算出的结果保留至两位有效数字，也可将样品的枯草芽孢杆菌菌落数记录为1.0~9.乘以10的指数据表示。报告每毫升或每克样品的枯草芽孢杆菌估计数，单位为CFU/g(mL)。示例1：
若第个稀释度(10-}）经确证后的菌落数为168和215,第二个稀释度(10:1)经确证后的落数为34和55,则：168 +215 + 34 + 55
N = 0. 1x(2+0. 1x2)x10- - 0. 0022= 2 145 450
按照GB/T8170数值修约规则得出每克或每毫升样品中含枯草芽孢杆菌估计数为2100000CFU/g(mL)或2.1×10\ CFU/g(mL).
示例2：
若只有最后一稀释液（10-4)经证实含枯草芽孢杆菌菌落数分别为120和130,则：120+130
=12500000
0. 1× 2 × 10- 0. 000 02 按照 GB/T 8170 数值修约规则修约,报告每克或每衰升样品中含枯草芽孢杆菌估计数为 12 000 000 CFU/g(mL)或 1.2×10' CFU/g(mL)。
营养琼脂(NA)培养基
蛋白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
1 000 mL
附录A
（资料性附录）
培养基和试剂
GB/T 26428--2010
溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在25℃时为7.3士0.2121℃灵
菌30min
A.2草兰氏染色
A.2.1结晶紫染色液
A.2.1.1成分
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
A. 2. 1. 2
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.2.2
革兰氏碘液
A.2.2. 1成分
麒化钾
蒸馏水
A. 2. 2, 2
将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。5
GB/T26428-2010
沙黄复染液
A.2.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A.2.3.2制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.2.4染色法
将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色渡，染色1min，水洗，滴加革兰氏碘液，作用1nin水洗；滴加95%乙醇脱色，约30s，水洗，滴加沙黄复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。A,37%氯化钠生长
A.3.1成分
强白陈
牛肉膏
氯化钠
蒸馏水
A.3.2制法
1 000 mL
溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在25C时为7.4土0.2。分装试管，121c灭30min。
3试验方法
取新鲜培养物接种于上述培养基中，36℃士1℃培养2d～7d,与未接种的对照管对比，目测生长情况。
A.4V-P测定
A.4.1培养基
A.4.1.1成分
蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
A. 4, 1.2制法
1000mL
溶解各成分于水中，必要时加热。调整pH值，使培养基pH值在25C时为7.0±0.2。分装试管，6
121灭菌30min
A.4.2试剂
氧氧化钠
试验方法
0.3%或源粉wwW.vv99.Net
GB/T26428--2010
接种菌于上述培养基中,36℃士1℃培养2 d4 d。取培养液和40%氢氧化钠等量相混。加少许肌酸，10 tin如培养液出现红色，即为阻性反应，有时需放置更长时间才出现红色反应。A.5
硝酸盐还原
A,5.1 培养基
A.5.1.1成分
蛋白陈
牛肉膏
飘化钠
硝酸钾
蒸馏水
A.5. 1.2 制法
1 000 mL
溶解各成分于水中,必要时加热。调整 pH值,使培养基pH值在25 ℃时为7.4士0.2。分装试管：121℃灭菌30min
A,5.2试剂
甲液：
乙腋：
二苯胺试剂：
A.5.3试验方法
对氨基苯磺酸
10 %乙酸溶液
甲萘胺
蒸馏水
10 %乙酸溶液
二笨胺
蒸馏水
浓硫酸
150 ml
150 mL
100 mL
接种菌于上述培养基中,36 ℃土1 ℃培养 2 d～4 d。加人甲液和乙液各 1滴,观察结果。如溶液变为红色、橙色、棕色为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，可加1滴～2滴二苯胺试剂，如不呈蓝色，也为硝酸盐还原阳性，呈蓝色则为阴性。7
GB/T26428—2010
A.6D-甘露醇发酵
A,6. 1培养基
A, 6. 1. 1成分
磷酸氢二铵
氯化钾
硫酸镁
酵母旁
D-甘蘑醇
0.04%溴甲酚紫
蒸馏水
A. 6. 1. 2制法
1 000 nL
除指示剂溴甲酚紫外，其余各成分溶解于水，必要时加热，调整pH值，使灭菌后培养基pH值在25℃时为7.0士0.2。加人指示剂漠甲酚紫，分装试管，115℃灭菌30minA.6.2试验方法
挑取小培养物接种于上述培养基中，36℃士1℃培养2d～5d。观察指示剂变黄，表示产酸，为阳性;不变或变蓝(紫)则为阴性
丙酸盐利用
A.7.1 培养基
A.7.1.1成分
硫酸镁·7H.0
磷酸氢二氨
磷酸氢二钾·3H20
氯化钠
丙酸钠
1%漠百量酚蓝水溶液
蒸馏水
A.7. 1. 2
1 000 mL
以上成分除指示剂外加热溶解，调整pH值，使培养基pH值在25\C时为7.0士0.2。加指示剂漠百里酚蓝，分装试管,121 'C高压灭菌30 min,摆成斜面备用。同时设不加丙酸盐的空白对照。8
A.7.2试验方法
GB/T 26428—2010
取新鲜培养物接种于上述培养基中，36℃士1℃培养48h，观察结果。培养基出绿色变为蓝色为阳性,培养基不变色为阴性
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