本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中角黄素残留量的液相色谱紫外检测方法和液相色谱串联质谱确证方法。 本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中角黄素残留量的测定和确证。

ICS67.050
中华人民共和国国家标准
GB/T22958—2008
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中角黄素
残留量的测定
液相色谱-紫外检测法
Determination of canthaxanthin residues in fugu,eel and baked eel-HPLC-UV method
2008-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2009-05-01实施
本标推的附录 A、附录B、附录C为资料性附录本标由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。GB/T22958—2008
本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国青海出入境检验检疫局和中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人：薄海波、星玉秀、余孔捷、贾光群、曹彦忠、丽丽、贾红卫、庞国芳1范围
河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中角黄素
残留量的测定
液相色谱-紫外检测法
GB/T 22958--2008
本标准规定了河豚鱼，鳗鱼和烤鳗中角黄素（canthaxanthin)残留量的液相色谱-紫外检测方法和被相色谱-串联质谱确证方法，
本标准适用于河豚鱼、鳗色和烤鳗中角黄素残留量的测定和确证。本方法的检山限为0.05mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6379.1测呆方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379.12004,ISO 5725-1:1994,IDTGB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2001,1SO5725-2：1994,IDT)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD）3原理
试样中的角黄素用乙睛提取，正已烷脱脂净化，高效液相色谱-紫外检测，外标法定量。高效液相色谱-串联质谱法确证。
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯。4.1水：GB/T6682，—级
4.2乙腈：色谱纯。
4.3正已烷：色谱纯。
4.4乙饱和的正已烷：取少量乙腈（4.2)加人正已烷（4.3中，充分混勾。静止分层后，取用上层正已烷。
4.5甲酸：忧级纯。
4.6无水硫酸钠：用前在650C灼烧4h，置于于燥器中冷却后备用。4.7焦性没食子酸。
4. 8 0. 1%甲酸:移取 1 mL甲酸(4.5),以水定容1 L，当天配制。4.9角黄素标准物质(CAS:514-78-3)：纯度≥95%。4.10标准储备溶液：准确称取角黄素标准品5.0mg（精确到0.1mg），用乙睛（4.2）溶解，转移至50mL棕色容量瓶中并定容至刻度。该溶液浓度为100μg/mL。储备液贮存在一18C冰柜中。4.11标推中间溶液，吸取1.00mL标准储备溶液（4.10），移人10mL棕色容量瓶中，用乙睛定容，该1
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溶液浓度为10μg/mL。1℃冰箱中保存。4.12标准工作溶液：吸取一定量标准中间溶液（4.11），用流动相稀释至所需浓度。使用前配制。4. 13滤膜:0.2 μm。
5仪器和设备
商效液相色谱仪：配有素外检测器。5.2
相色谱-审联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI源）。5. 3分析天平:感量 0. 1 mg和 0. 01 g各一台。5.4旋涡混匀器。
离心机:5 000 1/min。
移液器:1 ml.。
聚丙烯离心管：50 ml.。
族转蒸发仪。
5.9均质器。
6试样制备与保存
6.1试样制备
抽取河豚鱼、鳗鱼及烤鳗等样品约500g，可食用部分，绞碎，充分混匀，分装入洁净的容器内，密闭并做好标记。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染，且尽可能避光操作，尽量减少氧气接触机会并尽快完成。在样品提取时严格控制操作温度，最高不超过35℃，以防止角黄素含量发生变化。6.2 试样保存
试样于一18℃以下冷冻保存。
7测定步骤
7.1提取
称取5g试样（精确至0.01g）于50mL聚内烯离心管中，加入10g无水硫酸钠，0.1g焦性没食子酸，加乙睛2×20mL，均质提取1min。以3000r/min离心3min。合并提取液于另一个50mL案内烯离心管中。待净化。
7.2净化
在乙腈提取液中加人20mL乙睛饱和的正已烧（4.3），涡旋混句后振荡3min，以2000r/min离心2min，弃去上层正已烷，取下层乙睛20mL，旋转蒸发近千，用5mL乙定容，过0.2μm滤膜，待测定。wwW.vv99.Net
7.3测定条件
7.3. 1液相色谱参考条件
色谱柱;BEH Ci:，1.7μm，50 mmX2.1 mm(内径)或相当者a)
流动相乙腈+0.1%甲酸溶液(97+3)；e
流速：0.30 mL/min
柱温：30℃：
进样量：5.0μL；
f）检测波长：470nm。
7.3.2色谱测定
根据试样中被测物质的含量情说，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待测样液中角黄的响应值应在仪器线性响应范围内。标准工作液与待测样液等体积进样。在上述色谱2
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条件下，角黄素反、顺式异构体的保留时间分别为1.10rmin和1.26min，根据标准溶液色谱峰的保留时间和峰面积，对样液的色谱峰进行定性并用外标法定量。角黄素标准溶液的液相色谱图参见附录A中的图A.1。角黄素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图参见附录B中的图B.1。角黄素添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录C中的表C.1。7.4确证
液相色谱参考条件
色谱柱：BEHCi，l.7μm，50mm×2.1mm内径）或相当者：a)
流动相：乙晴（4.2）+0.1%甲酸（4.8)（97+3)流速：0.40mL/min;
柱温：35℃，
进样量:5.0 μ
质谱参考条件
离子源：电喷雾源 ESI,正离子模式(ESI十）：扫描方式：多反应监测(MRM)；
毛细电压：3.5kV；
锥孔电压：38V；
离子源温度：120℃;
去溶剂气温度：400℃；
专溶剂气（氨气）流量：800L/h锥孔气(氮气)流量(N2）:50 L/h;碰撞能量：20V;
碰撞气流量:0.1L/h；
检测离于对：定量：565.5/203.1定性：565.5/203.1,565.5/133.1。k)
7.4.3液相色谱-串联质谱确证
将各被测组分分别选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差士2.5%之内，且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表1规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。
表1定性确证时相对离子丰度的最大充许偏差相对离子丰度 K
充许最大偏差
7.5乎行试验
20 Kα 50
按以上步骤对同一试样进行平行试验测定。7. 6空白试验
除不称取试样外，均按上述步进行测定。8结果计算
角黄素残留量的测定结果按式(1)计算。XEX
式中；
试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（g/kg)：1020
以%表示
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-从标推工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL.)；V——样品溶液定容体积,单位为毫升(mL);m\样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g)。计算结果应扣除空白值。
9精密度
9.1般规定
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。
9.2重复性
在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，试样中角黄紫添加浓度范圃及重复性方程见表2。
化合物名称
角黄蔡
角黄囊添加浓度及重复性和再现性方程探加浓度范围
0. 05~~2. 0
注：m为两次测定结果的平均值，重复性限
单位为鎏克每千克
再现性限R
11grm0.6738lgm0.4549;lgR-0.63871gm—0.5289如果两次测定值的差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定9.3再现性
在再现性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R，试样中角黄素添加浓度范围及再现性方程见表2。
附录A
（资料性附录）
标准物质液相色谱图
角黄素标准物质液相色谱图见图A.1。0. 040
0, 010
-角黄紊反式体;
角黄紊顺式体。
角黄素标准物质液相色谱图
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1.80t/ruin
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驸录B
(资料性附录）
标准物质的多反应监测（MRM)色谱图角黄素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图见图B.1100
1—·角黄素反式体;
2——角黄素顺式体。
图B.1角黄素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图附录C
(资料性附录）
回收率
角黄素添加浓度及其平均回收率的试验数据见表C.1。表 C.1
样品基质
河豚鱼
角黄素添加浓度及其平均回收率的试验数据恭加浓度/(mg/kg)
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平均回收率/%
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