涂布平板法实验器材 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制 牛肉膏 0.3g
　　蛋白胨 1g
　　氯化钠 0.5g
　　琼脂 2g
　　自来水 100mL
　　pH 7.0～7.2 　　灭菌 1.05kg/cm2,22min
　　配制具体步骤
　　1．称量
　　按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中.牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯.也可放在称量纸上,称量后直接放入水中,这时如稍微加热,牛肉膏便会与称量纸分离,然后立即取出纸片.蛋白胨很易吸潮,在称取时动作要迅速.另外,称药品时严防药品混杂,一把牛角匙用于一种药品,或称取一种药品后,洗净、擦干,再称取另一药品,瓶盖也不要盖错.
　　2．溶化
　　在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解.待药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积.如果配制固体培养基,将称好的琼脂放入已溶化的药品中,再加热溶化,在琼脂溶化的过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底使烧杯破裂.最后补足所失的水分.
　　3．调pH
　　在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值,如果pH偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH值,直至pH达7．6.反之,则用1mol/L HCl进行调节.注意pH值不要调过头,以避免回调,否则,将会影响培养基内各离子的浓度.
　　对于有些要求pH值较精确的微生物,其pH的调节可用酸度计进行（使用方法,可参考有关说明书）.
　　4．过滤
　　趁热用滤纸或多层纱布过滤,以利结果的观察.一般无特殊要求的情况下,这一步可以省去（本实验无需过滤）.很多都是不需要过滤的.
　　5．分装
　　按实验要求,可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内.分装装置见图Ⅴ-1.
　　分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染.
　　(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜.
　　(2)固体分装分装试管,其装量不超过管高的1/5,灭菌后制成斜面,如图Ⅴ-2.分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜.
　　(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝.
　　6．加塞
　　培养基分装完毕后,在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞,以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染,并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）.
　　7．包扎
　　加塞后,将全部试管用麻绳捆扎好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道麻绳扎好.用记号笔注明培养基名称、组别、日期.三角烧瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结形式扎好,使用时容易解开,同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期.
　　8．灭菌
　　将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2）,121．3℃, 20分钟高压蒸汽灭菌.如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入冰箱内暂存.
　　9．搁置斜面
　　将灭菌的试管培养基冷至50℃左右,将试管棉塞端搁在玻棒上,搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜.
　　10．无菌检查
　　将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时,以检查灭菌是否彻底.

　　1．活材料：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌剂.
　　2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）
　　3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等.
　　四、实验方法
　　1．样品稀释液的制备 准确称取待测样品l0g,放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中,用手或置摇床上振荡20min,使微生物细胞分散,静置20-30s,即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管,吸取10-1稀释液lml,移入装有9ml无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml,移入装有9ml无菌水的试管中,也吹吸三次,即成l0-3稀释液；以此类推,连续稀释,制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）.
　　图22-1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养
　　用稀释平板计数时,待测菌稀释度的选择应根据样品确定.样品中所含待测菌的数量多时,稀释度应高,反之则低.通常测定细菌菌剂含菌数时,采用10-7、10-8、10-9稀释度,测定土壤细菌数量时,采用10-4、10-5、10-6稀释度,测定放线菌数量时,采用l0-3、10-4、10-5稀释度,测定真菌数量时,采用10-2、10-3、10-4稀释度.
　　2．平板接种培养 平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法.
　　（1）混合平板培养法 将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码,每一号码设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中,同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中,再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换）.然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基(图22-2),轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷疑后倒置,适温培养.至长出菌落后即可计数.
　　（2）涂抹平板计数法 涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）.再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3）,每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌.在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲.将涂抹好的平板平放于桌上20—30min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至长出菌落后即可计数. 涂布平板法实验器材 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制 牛肉膏 0.3g
　　蛋白胨 1g
　　氯化钠 0.5g
　　琼脂 2g
　　自来水 100mL
　　pH 7.0～7.2 　　灭菌 1.05kg/cm2,22min
　　配制具体步骤
　　1．称量
　　按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中.牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后倒入烧杯.也可放在称量纸上,称量后直接放入水中,这时如稍微加热,牛肉膏便会与称量纸分离,然后立即取出纸片.蛋白胨很易吸潮,在称取时动作要迅速.另外,称药品时严防药品混杂,一把牛角匙用于一种药品,或称取一种药品后,洗净、擦干,再称取另一药品,瓶盖也不要盖错.
　　2．溶化
　　在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解.待药品完全溶解后,补充水分到所需的总体积.如果配制固体培养基,将称好的琼脂放入已溶化的药品中,再加热溶化,在琼脂溶化的过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底使烧杯破裂.最后补足所失的水分.
　　3．调pH
　　在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值,如果pH偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸测其pH值,直至pH达7．6.反之,则用1mol/L HCl进行调节.注意pH值不要调过头,以避免回调,否则,将会影响培养基内各离子的浓度.
　　对于有些要求pH值较精确的微生物,其pH的调节可用酸度计进行（使用方法,可参考有关说明书）.
　　4．过滤
　　趁热用滤纸或多层纱布过滤,以利结果的观察.一般无特殊要求的情况下,这一步可以省去（本实验无需过滤）.很多都是不需要过滤的.
　　5．分装
　　按实验要求,可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内.分装装置见图Ⅴ-1.
　　分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染.
　　(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜.
　　(2)固体分装分装试管,其装量不超过管高的1/5,灭菌后制成斜面,如图Ⅴ-2.分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜.
　　(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝.
　　6．加塞
　　培养基分装完毕后,在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞,以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染,并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）.
　　7．包扎
　　加塞后,将全部试管用麻绳捆扎好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道麻绳扎好.用记号笔注明培养基名称、组别、日期.三角烧瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结形式扎好,使用时容易解开,同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期.
　　8．灭菌
　　将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2）,121．3℃, 20分钟高压蒸汽灭菌.如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入冰箱内暂存.
　　9．搁置斜面
　　将灭菌的试管培养基冷至50℃左右,将试管棉塞端搁在玻棒上,搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜.
　　10．无菌检查
　　将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时,以检查灭菌是否彻底.

　　1．活材料：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌剂.
　　2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（附录三、1）
　　3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等.
　　四、实验方法
　　1．样品稀释液的制备 准确称取待测样品l0g,放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中,用手或置摇床上振荡20min,使微生物细胞分散,静置20-30s,即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管,吸取10-1稀释液lml,移入装有9ml无菌水的试管中,吹吸3次,让菌液混合均匀,即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml,移入装有9ml无菌水的试管中,也吹吸三次,即成l0-3稀释液；以此类推,连续稀释,制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（图22-1）.
　　图22-1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样培养
　　用稀释平板计数时,待测菌稀释度的选择应根据样品确定.样品中所含待测菌的数量多时,稀释度应高,反之则低.通常测定细菌菌剂含菌数时,采用10-7、10-8、10-9稀释度,测定土壤细菌数量时,采用10-4、10-5、10-6稀释度,测定放线菌数量时,采用l0-3、10-4、10-5稀释度,测定真菌数量时,采用10-2、10-3、10-4稀释度.
　　2．平板接种培养 平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法.
　　（1）混合平板培养法 将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码,每一号码设置三个重复,用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中,同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中,再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时,吸管可不必更换）.然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基(图22-2),轻轻转动平板,使菌液与培养基混合均匀,冷疑后倒置,适温培养.至长出菌落后即可计数.
　　（2）涂抹平板计数法 涂抹平板计数法与混合法基本相同,所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）.再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3）,每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌.在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲.将涂抹好的平板平放于桌上20—30min,使菌液渗透入培养基内,然后将平板倒转,保温培养,至长出菌落后即可计数.