本标准规定了猪繁殖和呼吸综合症(PRRS)的诊断方法。本标准适用于猪繁殖和呼吸综合症的诊断。

GB/T18090—2000
猪繁殖和呼吸综合症(简称PRRS)是由PRRS病毒引起的-一种接触传染性疾病。各种年龄的猪均易感染。妊娠母猪感染后可引起流产、死胎、木乃伊胎及弱胎，仔猪可发生呼吸障碍和高病死率，其他猪常呈隐性感染或仅出现轻度的呼吸道症状。PRRS病毒有欧洲型和美洲型两种主要抗原型，分别以IV和VR-2332为代表株，型间具有明显的抗原交叉反应性。据现有资料，我国流行的毒株为美洲型。本病几乎发生于世界各养猪国家，并于九十年代中期传入我国。由于其对养猪业的严重威胁性，国际兽疫局(1996)已将本病列为B类传染病。大连动植物检疫局在国内率先开展了PRRS的研究工作，建立了具有与国际同等水平的病毒分离鉴定、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法。其他单位也相继建立了多种酶联免疫吸附试验等。
本标准是在综合我国科研成果的基础上，参照国际兽疫局（OIE)编写的《哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》(第三版，1996)编写的。其技术内容与OIE所推荐的基本一致。本标准的附录A、附录B和附录C都是标准的附录。本标准由农业部提出。
本标准起草单位：中华人民共和国大连动植物检疫局。本标准起草人：孙颖杰、苏永生、潘凤城、孙延峰、简中友。103
1范围
中华人民共和国国家标准
猪繁殖和呼吸综合症诊断方法
Diagnostic methods of porcine reproductiveand respiratory syndrome
本标准规定了猪繁殖和呼吸综合症(PRRS)的诊断方法。本标准适用于猪繁殖和呼吸综合症的诊断。2诊断方法的种类和选用
GB/T18090—2000
PRRS的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊必须依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）、间接免疫荧光试验（IFA）、间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA)和血清中和试验(SN)等。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。其余4种方法主要用于检测PRRS病毒抗体。IPMA、IFA和间接ELISA三者特异性相似，但以间接ELISA的敏感性最高。应用这三种方法一般不易区别病毒的抗原类型，故多适用于确定病性。SN反应具有明显的抗原型别差异，因此，它既适用于确定病性，也适用于鉴定病毒的抗原类型。中和抗体出现最晚，不适合于早期诊断。本标准指定上述五种实验室诊断技术为我国进出境和国内生猪PRRS的诊断方法，保证了我国对PRRS的诊断与国外的一致性。在实际应用时，可根据需要和条件，从中选用1～2种方法即可。3病毒的分离与鉴定
3.1材料准备
3.1.1器材：96孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳（C0),)恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径0.2um的微孔滤膜、普通光学显微镜。3.1.2试剂：RPMI1640营养液、犊牛血清、青霉素（104IU/mL.）与链霉素（10*μg/mL）溶液、7.5%碳酸氢钠溶液等。
3.1.3细胞培养物：猪原代肺泡巨噬细胞培养物（PAM）或MARC-145或HS2H细胞。PAM由无PRRS猪获取，并经批次检验合格，制备和检验方法见附录B。MARC-145或HS,H细胞由国家指定单位提供。
3.1.4样品
3.1.4.1样品的采取和送检：在发病早期，无菌地采取病猪的血清或腹水。对病死猪（如流产的死胎）和扑杀猪（如弱胎猪），应立即采取肺、扁桃体和脾等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即检查者，应放-~25℃~～-—30℃冰箱中，或加50%甘油生理盐水，4℃保存送检。3.1.4.2样品的处理：血清和腹水可直接使用。肺、脾和扁桃体等组织可单独使用，也可混合后使用。各组织剪碎后研磨成糊状，加入RPMI11640营养液，制成10%悬液，3000×g离心15min，吸取.1清液，加入青霉素500IU/ml、链霉素500μg/ml、庆大霉素500μg/mL和两性霉素B200μg/ml。怀疑有细菌国家质量技术监督局2000-04-26批准104
2000-10-01实施
GB/T18090—-2000
污染的样品，也可用0.2双m微孔滤膜过滤处理。3.2操作方法
3.2.1稀释样品：取96孔细胞培养板每孔加入细胞培养液RPM11640（含犊牛血清10%、青霉素100IU/ml.、链霉素100μg/mL、庆大霉素50μg/mL、两性霉素B10μg/mL、pH=7.2)90μL,在A1和C1孔内加入同一份已处理的样品各10μL（样品10×稀释）。将板轻轻摇动后，从A1和C1排孔各取10μL分别移入B1和D1排孔内（样品100×稀释）。除第6和第12列留作正常细胞对照外，其他各孔的样品稀释方法同上。振动稀释板后加盖，置4C冰箱内保存备用。3.2.2制备细胞板：已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离物特别是欧洲型病毒株的良好生长，因此病毒分离应首选PAM细胞，先将PAM细胞泥用细胞培养液RPMI1640稀释，使细胞终浓度为1×10°细胞/mL。或将MARC-145或HSzH细胞用MEM细胞营养液稀释，细胞终浓度为5X10*细胞/ml。然后，在另一块96孔细胞培养板上每孔加入上述细胞悬液100μL。按照上述操作，每板可检测20份样品，每份样品重复2个滴度。第6和第12列留作正常细胞对照（不接种样品）。
3.2.3接种样品：由样品稀释板每孔内各吸取稀释的样品液50μL，接种于已形成细胞单层的细胞板相应的孔内（第一代）。细胞板加盖后，放人37℃5%二氧化碳保湿恒温箱中培养，每天观察致细胞病变作用（CPE），连续观察2d～5d。CPE通常在接种后1d～4d内出现，主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落。
3.2.4培养物盲传：根据第一代培养物CPE出现的情况（通常在接种后的第2d～3d)安排盲传。盲传时，不论CPE有无，一律各取孔内混悬液25μL，移入新细胞板相应的孔内。再于37C5%二氧化碳保湿恒温箱中培养2d～5d，每天观察CPE。3.3结果的判断和解释
在第二代培养结束时，不论是否出现CPE，对所有的孔必须采用免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）或间接免疫荧光试验（IFA)进行终判；只要对PRRS病毒阳性血清呈现阳性反应，则被认定为PRRS病毒分离阳性。
4免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）4.1材料准备
4.1.1器材：微量移液器、倒置显微镜等。4.1.2试剂
4.1.2.1IPMA诊断板的制备：见附录B。4.1.2.2标准阳性血清、标准阴性血清和免抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。4.1.2.3洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶液依照附录A自行配制。4.1.3样品：采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜透明不溶血无污染，密装于灭菌小瓶内，4C或-30°℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释。4.2操作方法
参照图。
GB/T 18090--2000
Alccc s6 s6 s6
V+一感染PRRS病毒的细胞列;V-一未感染PRRS病毒的细胞列;C一空白对照孔;P一标准阳性血清对照孔；N-标准阴性血清对照孔;S1、S2、S3等一被检血清编号图1IPMA和IFA诊断板加样示意图4.2.1取已作20倍稀释的被检血清加入IPMA诊断板同一排相邻的2个病毒感染细胞孔（V+）及其后的1个未感染细胞孔（V）内（参照图1)，每孔50μL，同时设立标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，以血清稀释液代替血清设立空白对照，封板并于4C条件下过夜。4.2.2弃去板中液体，用洗涤液洗板3次，每孔100μL，每次1min～3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。
4.2.3每孔加入工作浓度的免抗猪过氧化物酶结合物50μL，封板后放在保湿盒内于37℃恒温箱中感作 60 min。
4.2.4弃去板中液体，洗涤三次，方法同4.2.2。4.2.5每孔加入显色/底物溶液50μL，封板于室温（18℃～24℃）下感作30min。4.2.6弃去板中液体，洗涤1次，方法同4.2.2，再用三馏水洗涤2次，最后在吸水纸上轻轻拍干，待检。
4.3结果判定与解释
将IPMA诊断板置于倒置显微镜下判读。在对照标本都成立的前提下，即空白对照感染细胞孔(P·Vt)和未感染细胞孔(P·V\)均应为阴性反应；标准阳性血清对照感染细胞孔(P·V+)应呈典型阳性反应，未感染细胞孔（P·V-)应为阴性反应；标准阴性血清对照感染细胞孔(N·V+）)和未感染细胞孔(N，V-)均应呈阴性反应；被检血清未感染细胞孔(V-）不应出现阳性反应。被检血清标本的细胞浆（可能仅见于部分细胞)出现弥漫状或团块状棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性，记作IPMA（+）；无棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阴性，记作IPMA（一）。IPMA（十）者表明被检猪的血清中含有PRRS病毒的抗体，5间接免疫荧光试验(IFA)
5.1材料准备
5.1.1器材：荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等、5.1.2试剂
5.1.2.1IFA诊断板的制备：见附录B。5.1.2.2兔抗猪异硫氰酸荧光黄（FITC)结合物、标准阳性清和标准阴性血清，由国家指定单位提供。
5.1.3样品：采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或一30C:冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统-一编号，并用PBS液作20倍稀释。5.2操作方法
5.2.1取IFA诊断板，编号，弃去板中的乙醇溶液，置超净工作台中风干，每孔加100uLPBS液洗---次，弃去PBS液并在吸水纸上轻轻拍干。106
GB/T18090—2000
5.2.2在编号对应的孔内加入20倍稀释的被检血清：同一排相邻的感染细胞孔2个及其后无感染细胞孔1个，每孔100μL，同时做标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用PBS液代替血清。置37C恒温箱中感作45min。
5.2.3奔去板中血清，用PBS液洗板4次，每孔100μL，每次3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。5.2.4每孔加入工作浓度的兔抗猪FITC结合物50μL，在37C恒温箱中感作45min5.2.5弃去板中结合物，同5.2.3方法洗涤3次后，最后在吸水纸上轻轻拍干。5.3荧光显微镜检查及判定与解释荧光显微镜采用蓝紫光（激发滤板通常用BG12，吸收滤板用OG1或GG。），在5倍～10倍目镜下检查。标准阳性血清对照中感染细胞孔(P·V+)应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔(P·V-)不应出现特异性荧光；标准阴性血清对照、空白对照中感染细胞孔(N·V')和未感染细胞孔(N·V-)均不应出现特异性荧光；被检血清对照中未感染细胞孔（C·V-)不应出现特异性荧光。被检血清样品感染细胞孔(N·Vt)出现特异性胞浆亮绿荧光的判为阳性;否则，判为阴性。6间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）6.1材料准备
6.1.1器材：96孔平底微量反应板、微量移液器、酶标测定仪、恒温箱、保湿盒等。6.1.2试剂
6.1.2.1PRRS病毒抗原和正常细胞对照抗原，由国家指定单位提供。使用前，按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度。
6.1.2.2免抗猪IgG辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。6.1.2.3PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。
6.1.2.4抗原稀释液、血清稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液等，依照附录A自行配制。6.1.3样品：采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4C或一30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释。6.2操作方法
参照图2。
CVCVCVC
V一为PRRS病毒抗原包被列;C一正常细胞抗原包被列;P一标准阳性血清对照孔；N一标准阴性血清对照孔S1、S2、S3等一被检血清编号图2间接EIISA诊断板加样示意图6.2.1包被抗原：取96孔平底微量反应板，于奇数列加工作浓度的病毒抗原，偶数列加工作浓度的对照抗原，每孔100μL（参照图2），封板，置保湿盒内放37℃恒温箱中感作60min，再移置4C冰箱内过夜。
6.2.2洗板：弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔100μL，洗涤3次，每次1min。在吸水纸上轻轻拍107
GB/T 18090--2000
6.2.3封闭：每孔加入封闭液100μL，封板后置保湿盒内于37℃恒温箱中感作60min。6.2.4洗涤：方法同6.2.2。
6.2.5加血清：反应板按图2编号后，对号加入已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。每份血清各加2个病毒抗原孔和2个对照抗原孔，孔位相邻。每孔加样量均为100uL。封板，置保湿盒内于37℃恒温箱中感作30min。
6.2.6洗板：方法同6.2.2。
6.2.7加酶标抗体：每孔加工作浓度的酶标抗体100uL，封板，放保湿盒内置37℃恒温箱中感作30 min。
6.2.8洗板：方法同6.2.2。
6.2.9加底物：每孔加入新配制的底物溶液100μL，封板，在37℃恒温箱中感作15min。6.2.10加终止液：每孔添加终止液100uL终止反应。6.3光密度（OD)值测定与计算
6.3.1OD值测定：在酶标测定仪上用入一650nm读取反应板各孔溶液的OD值，记入专用表格。6.3.2OD值计算
按下式分别计算标准阳性血清、标准阴性血清和被检血清与2个平行抗原孔反应的OD值的平均值。
标准阳性血清(P)与病毒抗原(V)反应的均值P·V(OD65o)按式(1)计算：P . V(OD650) =［A1(OD65) + B1(OD6s0)]/2标准阳性血清(P)与对照抗原(C)反应的均值 P·C(ODso)按式(2)计算：P·C(OD50）=［A2(OD650）+B2(OD650)]/2标准阴性血清(N)与病毒抗原(V)反应的均值N·V(ODs5o)按式(3)计算：N . V(ODs50) = [C1(OD650) + D1(OD650)]/2被检血清(S)与病毒抗原(V)反应的均值S·V(ODso)按式(4)计算：（1）
·（2)
.......( 4)
S· V(ODg50) = [E1(OD650) + F1(ODs50)]/2(以S1 血清为例)
被检血清(S)与对照抗原(C)反应的均值S·C(OD65c)按式(5)计算：S·C(ODsso）=［E2(OD650）+F2(OD65)]/2（以S1 血清为例)6.3.3按式(6)计算被检血清OD值与标准阳性血清OD值的比值S/P：S/P = [S. V(ODs5o) -- S ·C(ODs50)]/[P. V(ODsso) -- P . C(OD650)]6.4结果的判定与解释
...(5)
6.4.1有效性判定：P·V(OD65o）与N·V(ODs50)的差值必须大于或等于0.150时，才可进行结果判定。否则，本次试验无效。
6.4.2判定标准与解释
a）S/P比值小于O.3，判定为PRRS病毒抗体阴性，记作间接ELISA（-）。b）S/P比值大于或等于0.3，小于0.4，判定为疑似，记作间接ELISA（士）。c）S/P比值大于或等于0.4，判定为PRRS病毒抗体阳性，记作间接EI.ISA（+）。间接EI.ISA(+）者表明被检猪血清中含有PRRS病毒抗体。7 血清中和试验(SN)
7.1材料准备
7.1.1器材：96孔细胞培养板、微量移液器、二氧化碳(CO)恒温箱、倒置显微镜等。7.1.2病毒：美洲标准株ATCCVR-2332或欧洲标准株LV，由国家指定单位提供。使用前按附录C方法滴定病毒效价后，用含20%健康猪新鲜血清的EMEM营养液（pH7.2)将其稀释至200TCID50/108
25L，作为工作病毒液。
GB/T 18090--2000
7.1.3细胞：MARC-145或HS,H传代细胞，由国家指定单位提供。使用时，用细胞分散液消化、分散细胞，计数，再用EMEM营养液（含犊牛血清10%，青素100IU/mL，链素100μg/mL，pH=7.2）稀释至10%细胞/mL。
7.1.4试剂
7.1.4.1PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供，使用前经56℃灭活30min，并按说明书规定进行稀释。
7.1.4.2健康猪新鲜血清：无菌来自3～8月龄的无PRRS的健康猪，可于70℃低温冰箱保存。使用时不灾活。
7.1.5样品：无菌采集被检猪血清，血清必须新鲜、透明、无溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃保存或立即送检，检测前经56℃灭活30min。由于中和抗体产生稍晚，故该血清以在疾病中后期或病毒感染后2~～3周时采集为宜。
7.2操作方法
参照图3。
被检血清毒性对照
1001010.11
细胞对照病毒对照
阴性血
清对照
阴性血
清对照
细胞对照
P-标准阳性血清对照;N一标准阴性血清对照;S1、S2,S3等-被检血清编号;100、10、1、0. 1-病毒浓度 TCIDso图3血清中和试验第1块板加样示意图7.2.1加营养液：取96孔细胞培养板，编号，于各血清检测孔内加入EMEM营养液（含10%犊牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/mL链霉素，pH=7.2)25μL，细胞对照区各孔加50μL，病毒对照区各孔不加（参照图3）
7.2.2加被检血清：以单头微量移液器精确吸取已作灭活处理的被检血清，在各排头两孔各加入25斑。每份被检血清须平行安排两排，即每个稀释度两孔。7.2.3稀释被检血清：从第2列开始依次向后将被检血清作倍比稀释，使第2、3、4、5、6列孔的血清稀释倍数依次为2°、22、2°、2″、25。稀释时，用8头微量取样器先在第2列孔内吹吸数次，充分混匀后吸取25μl.移入第3列，同前混匀后取25μL移入第4列，以下依次进行。当第6列各孔混匀后，各吸取25μl弃去。稀释过程中切勿产生气泡。7.2.4稀释对照血清：同7.2.3法进行标准阳性血清和标准阴性血清稀释。7.2.5加病毒液：除血清毒性对照、病毒对照和细胞对照外，各孔添加用含20%健康猪新鲜血清E-MEM营养液，将病毒液稀释成200TCIDso/25μL的工作病毒液25μL。7.2.6病毒对照：取灭菌试管4支，用20%健康猪新鲜血清EMEM营养液（pH7.2)将病毒液稀释至含毒量为200TCIDso/25μL、20TCIDso/25μL、2TCIDso/25μL和0.2TCIDso/25μL4个滴度，然后参照图3各取25μL加入相应的孔内（每个滴度4个孔），再于各孔内加入25μL2倍稀释的标准阴性血清。此时,病毒浓度分别降为100TCIDso/25μL、10 TCIDso/25 μI.、1TCIDss/25 μL和 0.1TCID50/25ul.
7.2.7中和感作：将培养板放入37C的5%二氧化碳保湿恒温箱中感作60min。109
GB/T 18090---2000
7.2.8添加细胞：于每孔内加入配制好的MARC-145或HS2H细胞悬液50μL。7.2.9培养：封板后，放入37℃的5%二氧化碳保湿恒温箱内培养。7.3观察与记录
在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作用（CPE）。每天观察一次，连续观察5天，并将观察结果记入专用登记表内。PRRS病毒在MARC-145或HSH细胞上生长，引起的CPE主要是：细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落。
7.4中和效价计算和结果判定
在各对照组符合下述要求时，本次中和试验才成立。a）病毒对照：病毒浓度为0.1TCID5.的各孔不应出现任何CPE，100TCID5的各孔均应出现CPEb）血清毒性对照：相当于试验中最低稀释度(本标准中为2倍)的被检血清对细胞应没有任何毒性作用。
c）细胞对照：在整个试验中应直保持良好的形态和特征。d）阳性血清对照：试验中所显示的能抑制CPE出现的血清最高稀释度不应比其已知滴度差1个滴度以上。
e）阴性血清对照：各稀释度均应出现CPE。对被检血清的中和效价进行计算。其血清中和效价为能抑制平行两孔或两孔中一孔出现CPE的血清最高稀释倍数的倒数。血清中和效价大于或等于1：4，判定为血清中和试验阳性，记作SN（十）；小于1：4，判为阴性，记作SN（一）。SN(十）表示被检猪血清中含有PRRS病毒抗体。8综合判定
当在临床上怀疑有PRRS病毒感染时，可根据实际情况，由上述五种方法中选用一种或两种方法进行确诊。对于未接种过PRRS疫苗或已超越疫苗免疫期的猪，经任何一种方法检测呈现阳性结果时，都可最终判定为PRRS病毒感染猪。对接种过PRRS灭活疫苗并在疫苗免疫期内的猪，当病毒分离鉴定试验为阳性结果时，可终判为PRRS病毒感染猪；当仅血清学试验呈阳性结果时，应结合病史和疫苗接种史进行综合判定，不可律视为PRRS病毒感染猪。110
GB/T 18090—2000
附录A
(标准的附录）
血清学试验中试剂的配制
A1 PBS液(0. 01 mo1 /L PBS,pH=7.2)用于 IFA氯化钠(NaCI）
氯化钾（KCI）
碳酸氢钠（NaHCO,）
磷酸二氢钾（KH,PO）
兰蒸水加至
保存于4C备用。免费下载标准就来唯久标准网
1 000 mL;
A2洗涤液(0.01 mol/L PBS-0.05%吐温-20,pH=7.4)用于IPMA和间接ELISA磷酸二氢钾（KH,PO）
磷酸氢钠(Na2HP0·12H,O)）
氯化钠(NaCI）
氯化钾(KCI)
吐温-20
三蒸水加至
现用现配。
1 000 mL
3抗原稀释液（0.05mo1/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)用于间接ELISAA3
碳酸钠（Na2CO，）
碳酸氢钠（NaHCO）
三蒸水加至
4℃保存，周内用完。
A4血清稀释液用于IPMA和ELISA
为含1%牛血清的“A1”液。
A5封闭液用于间接ELISA
1000mL。
为含1%犊牛血清白蛋白或10%马血清的“A1”液。A6显色/底物溶液用于IPMA
A6.1AEC贮存液
称取氨乙基咔噬（3-amino-9-ethyl-carbazole，AEC)4 mg溶于二甲基甲酰胺(N,N-dimethy-for-mamide)4mL中，充分溶解后置4℃避光保存。A6.2乙酸钠溶液
乙酸钠(CH,COONa)）
加三馏水至
用冰乙酸调整至pH=5.0。
1 000 mL:
A6.3乙酸盐缓冲液
冰乙酸(CH,COOH)
乙酸钠溶液
三馏水
充分混匀。
A6.4显色/底物溶液（AEC-H.O2）乙酸盐缓冲液
AEC贮存液
30%过氧化氢（H,02）
GB/T 18090--2000
19 mL;
0. 067 mL;
充分混合后装于褐色玻璃瓶内避光存放。现用现配。A7底物溶液用于间接ELISA
A7.10.1mol/L柠檬酸溶液
柠檬酸(C.H.O,）
加三馏水至
A7.20.1mol/1.磷酸氢二钠溶液
磷酸氢二钠(Naz2HPO.·12H,O)
加三馏水至
A7.3底物溶液（TMB-H,Oz）
0.1mol/L柠檬酸溶液
0. 1 mol /L磷酸氢二钠溶液
四甲基联苯胺(TMB)
30%过氧化氢（H202）
100mL。
100 mL。
40.0mg；
充分混合后装于褐色玻璃瓶避光存放。现用现配。3终止液用于间接ELISA
1 mol/L 氢氟酸(HF)溶液。
附录B
（标准的附录）
猪肺泡巨噬细胞(PAM)制备、鉴定、保存与复苏B1试剂准备
B1.1磷酸盐缓冲盐水(PBS)
a）原液甲
氯化钠(NaCI）
氯化钾（KCI）
磷酸氢二钠（Na2HPO）
磷酸二氢钾（KH,PO,）
溶于500mL三馏水中，再加入5mL0.4%酚红液，加三馏水至800mL，56kPa20min灭菌备用。b）原液乙
氯化镁(MgCl2·6H20)
加三馏水至
56kPa20min灭菌备用。
c）原液丙
氯化钙（CaCl,）
GB/T 18090—2000
100mL。
溶于100ml.三馏水中，56kPa20min灭菌备用。d）工作液
原液甲
原液乙
原液丙
8份；
1份，
1份。
充分混合后备用。必要时，可适量加入抗生素（青霉素10°IU/mL、链霉素10°μg/mL、庆大霉素10°μg/mL），不加制霉菌素。B1.2细胞生长液
含10%犊牛血清的RPM11640营养液（含青霉素100IU/mL、链霉素100μg/ml、庆大霉素50 μg/ml.)。
B1.3细胞冻存液
取细胞生长液8.0mL，加人分析纯二甲基亚砜（DMSO)2.0mL，混合均匀。不加制霉菌素。B2PAM的制备
取4～8周龄的SPF猪或被证实无PRRS病毒感染的健康猪，动脉放血致死后，立即无菌操作取出肺，切勿划破被膜。每次用约200mLPBS液从气管灌入肺，挤压灌洗3～4次，收集灌洗液，1000×g离心10min，得到的巨噬细胞泥用PBS液再悬浮和离心洗涤2～3次。最后的细胞泥用50mL细胞生长液悬浮，进行细胞计数，用细胞生长液稀释使细胞浓度达4×10//1.5mL。所得新鲜巨噬细胞立即应用或定量分装后冻存。
B3PAM的冻存
取细胞浓度为8×10/1.5mL的细胞悬液，加入等量细胞冻存液，缓慢滴加，边加边振摇。加毕，立即用聚苯乙烯管分装，每管1.5mL，放一70℃过夜，转入液氮中保存。液氮保存各批巨噬细胞，不可混合。B4PAM的批次试验
每批巨噬细胞应检验合格后再使用。方法是，在96孔细胞培养板上用已知滴度的标病毒感染巨噬细胞，并用标准的阳性血清和阴性血清进行IPMA或 IFA测定。只有能支持特定滴度的标准病毒良好生长的巨噬细胞，方可用于试验。B5PAM 的复苏
从液氮中取出冷冻细胞管，立即投入温水（38℃左右）中迅速解冻。将细胞移入10倍量的RPMI1640营养液（pH=7.2)中，1000Xg离心10min，弃去上清液，沉淀的细胞用细胞生长液悬浮，计数，稀释至要求的细胞浓度后，即可使用。B6IPMA诊断板的制备
用细胞分散液消化Marc-145或HS2H细胞，用细胞营养液稀释成5×10*细胞/mI，加入PRRS美洲或欧洲标准毒、使其最终浓度为100TCID5o/25μL，混合后接种96孔细胞培养板1、2、4、5、7、8、10、113
GB/T18090--2000
11列的各孔内，每孔加100μL。在3、6、9、12列的各孔内加100μL未感染病毒细胞悬液（参照图1）。把细胞培养板放在37℃、5%CO培养箱中培养48h-～72h。当细胞出现20%CPE时，弃去培养液，用PBS液（100μL/孔)洗一次，每孔加80%丙酮水溶液100μL，把板置于4C条件下固定30min。弃去丙酮液，在纸巾上拍千，放置室温下完全干燥后一70C保存备用。B7IFA诊断板的制备
用细胞分散液消化Marc-145或HS2H细胞，用细胞营养液稀释成5X10*细胞/mL，加入PRRS标准毒，使其最终浓度为100TCID50/25μL，加到96孔细胞培养板的1、2、4、5、7、8、10、11列各孔内，每孔100ul。在3、6、9、12列各孔内加入未感染病毒细胞悬液100μL（参照图1)。将该细胞培养板置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养60h～68h。弃去培养液，每孔加入预冷的无水乙醇100μL，将此细胞培养板置于－20℃或70℃冰箱中备用。附录C
（标准的附录）
猪繁殖和呼吸综合症病毒TCID50测定C1材料准备
C1.1器材：48孔细胞培养板2块、微量移液器、恒温箱、倒置显微镜等。C1.2病毒：美洲型标准株ATCCVR-2332或欧洲型标准株LV，向农业部指定单位索取。C1.3细胞：MARC-145或HS2H传代细胞，向农业部指定单位索取。使用时，细胞经细胞分散液消化分散后计数，用EMEM营养液（含犊牛血清10%、青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL，pH7.2)稀释至10°细胞/mL。
C2操作方法
C2.1稀释病毒：取洁净无菌的48孔细胞培养板，于第1孔加EMEM营养液200μL，其余各孔加225μI；换吸头，再于排头第1孔添加病毒液50μL，将混合液充分混匀。换吸头，吸取25μL移于第2孔，混合。更换吸头，再吸取25μL加入第3孔。连续如此操作至第10列，作成10个连续10倍的稀释液，使病毒稀释度依次为5×10°5×10、5×102、5×10°.5×101、5×105、5×10°5×10、5×10%、5×10%。改用多头微量取样器吸取每一稀释度的病毒液50uL移入另一块48孔（或96孔）细胞培养板，每个稀释度的病毒液平行移种4孔。剩下的各孔加50μLEMEM营养液，留作细胞对照。C2.2添加细胞：于细胞培养板各孔内添加50μL工作浓度的细胞悬液。此时，病毒稀释度依次变为10'、102、103、10*、105、10%、107、108、10%、101°。C2.3培养：封板后，放37℃C5%二氧化碳保湿恒温箱内培养。C3观察与TCID50计算
在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作用（CPE）。每天观察一次，并将观察结果记入专用登记表内。观察天数为直至出现CPE终点，即看到能够引起病毒增殖的病毒最高稀释度。对照细胞应始终保持良好形态和特征。
用Reed-Muench法、内插法或Karber法计算该病毒培养物的TCIDso/0.05ml。114
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。