本标准规定了牛皮蝇蛆病（ｂｏｖｉｎｅｈｙｐｏｄｅｒｍｏｓｉｓ）诊断技术的要求，包括临床诊断、动物剖检和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）。本标准适用于牛皮蝇蛆病的诊断。

ICS 11. 220
中华人民共和国国家标准
GB/T22329—2008
牛皮蝇蛆病诊断技术
Diagnostic tcchniques for bovine hypodermosis2008-08-22发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2008-12-01实施
本标准的附录A、附录B和附录C均为规范性附录。本标准中中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。本标准主要起草人：殷宏、罗建勋，关贵全。GB/T22329—2008
１范围
牛皮蝇病诊断技术
GB/T 22329—2008
本标准规定了牛皮蝇姐病（bovinehypadermosis）诊断技术的要求：包括临床诊断.动物检和酶联免疫吸附试验（ELISA）。
木标痛适用予牛皮蛇病的诊断
2临床诊断及剖检检查
2, 1临床诊断
牛感染皮后，一般不呈现明显的临床症状，但严童感染时，幼畜可表现出消瘦、生长經慢，贫血，母牛产乳量下降，役声的使役能力降低等症状。当皮蝇幼虫钻人脑部时，可引起神经症状，如作后退运动、突然倒地、麻痹或晕嵌等，重可造成死亡：此外，由于第三期幼虫在皮肤上形成穿孔，细菌感染而引起化脓，形成瘘管，常有脓液和浆液流出，瘘管逐渐愈合，形成斑痕。但上述症状只能作为诊断的参考指标，不能作为确诊的依据，只有当在牛的背部发现瘤肿状隆起和皮下蜂窝组织炎，耳可挤出第三期幼时:方能确诊。
2.2剖检检查
当对疫区开展流行病学调查时；经常采用此方法：重点检查部位为食道黏膜、背部皮下，瘤胃浆膜、大网膜、食道浆膜等部位，如发现第一期、第二期或第三期任一阶段的幼虫，便可确诊。2.2.1第期幼虫的形态
呈乳向色,长3. 5 mm~～12 mm,宽 0. 75 inm~-2 mm,前端稍尖。
2.2.2第二期幼虫的形态
呈浅萱自色，长11mm~15nm，宽3mm~6mm腹而微随，背面平。外观口钩仪见两个黄褐色的小圆点，被此分离。
2.2.3第三期幼虫的形态
鸡体长19mm~25mm，宽8mn~~11mm，长宽比例(2.3~2.1)：1:背面平,腹面噬起，侧面有疣状突，色泽因成熟程斑不同面异，由淡黄白至淡褐色黄褐色以至黑色，体具11节（扇部8节、腹部8节），伪头部县一对头尴器，被此分离。口钩退化为累色国点3酶联免疫吸附试验（enzyme-linked imimunosorbentassay;ELISA)）3.1试验材料
3.1.1抗原
制备方法见附录A。
3.1.2标准阳性血清
自牛皮蝇姐病流行区颈静脉采集背部有瘤包牛的血液，分离血清，经国外商品化试剂盒检测为阳性后，按3：1（3休积血清：1体积甘油）加人甘油，混勾，分装于1.5mL离心答，一20℃保存备用。3.1.3标准阴性血清
自无牛皮归病流行的南方省份经颈静脉采集牛的血液，分离血清，经国外商品化试剂盒检测为阴性后，接3：1(3休积血清：1体积甘油）入甘油，混句，分装于1.5mL离心管，-20℃保存备用。3.1.4酶标记二抗
辣根过氧化物标记的免抗牛IgC，自生化试剂公司购买。全品秋伴网
GB/T22329—2008
3.1.5血清样品的采集和处理
颈静脉采某动物血清，加叠氮化钠(0.01%>或硫柳汞(0.01为)进行防腐：4\C冷戴保存。3.1.6溶液配制
自行配制，配置方法见附录B。
3.2操作方法
3.2.1抗原包被
用抗原包被液将抗原按使用说明稀释至工作浓度；用加样器加工作浓度抗原至ELISA反应板各孔内，每孔100uL，加盖后在37C温箱内孵育1然扇置4冰箱过夜：将包被液用净，用洗涤液在洗板机上按3×300μL程序，或用洗瓶重基说涤5次3.2.2封闭
每孔加入封闭液200u
3.2.3血清稀释
用血清稀释液将待槛
C温籍肉育30min，甩干，按3.2.1方然洗涤。标雅血清作1：200 稀释
3.2.4加样
接照附录C格式每孔加100
清对照和标准阴性清射最。空片ICC u 而清释,瓶后3?℃
3.2.5加醇标记景抗
按说明书用漫将标记：
液，加盖后上37夏
翼内孵育「 h
3.2.6加底物
每孔加人现配菌
底物溶液
3.3判定
3.3.1酶联免疫睾测慢测定
用空白对照调
标准阳性孔和标准
血清的半均OD值)
3. 3. 2结果判定
405nni
的乎均
對，测定
3.3.2.1当结果有效时剩
OT比值=
(1)求出(D比值。
照、酶记
二对照、标准阳性呢
二抗魔孔（，C2D1，12)各加
霸洗涤。
，但空腹对聪乳贝加捐应稀释
樱育40min
直），分别算出海份被检样品孔L清的平离I值，N为标准阴性
腾拦品平均OI）值-标推阴性血清采胸OD霜X100%
标阳世清平均OD值一标推阴性血清平均C值1
OD比值小于或等争15%,定ELISA溢服性（—);U比值在16%～20%.判定为3. 3. 2. 2
ELISA法疑似（+);OD比值大于或雾于21%，判定为ELISA法归程。疑似者复检：-次，仍为疑似者判为阳性：
附录A
（规范性附录）
抗原的制备
GB/T22329—2008
A.1取100条新鲜采集或一20℃保存的纹皮蝇一期虫，置于干净的50mL烧杯中，用剪刀剪碎。A.2加入100 mL pH7.2的磷酸盐冲液(PBS),4℃搅拌过微。A.3第二天加人15.54g硫酸铵，4C播3mn。A.410000r/min，4℃离心20n，丢弃沉涎，收集上清液。A.5在上清液中加人15.54吨硫酸铵，4轻摇30F0000r/，4C离心20min，弃上清，收集沉淀。
A.6将沉淀重溶于20库
用 pH7.2 磷酸盐缓液
A.7取出透析产
2磷酸盐缓冲液中，装人透析袋，车4℃在精水中揽动透析1h，然后换透析过
及.8收集上清，厘费外鑫北光度存备用。
。分装亲1.51.离心管，
GB/T22329—2008
谢录B
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溶液能制
B.1抗原包被液(pI9.6,0.05mo1/L碳酸盐缓冲液）磺酸氨钠(NaHCO）
碳酸钠（Na.CO,）
蒸馏水
900 mL
用 1 Ⅲol/L 的盐酸调 pH值至 9. 6,加蒸罐水至 1 000 mL,于 4 ℃保存备用。B, 2洗涤液(0, 1 mnI/I.,pH 7. 4 PBST)B.2.1磷酸盐缓冲液(pH7.2)
氯化钠(NaC1)
化钾(KCI)
磷酸二氯钾磷酸氢二钠(Na.HPO,·12H,0)
蒸馏水
用1mol/L的盐酸或1mol/L的氢氧化钠调pH值至7.2,加燕馏水至5I.B, 2. 2洗涤液
磷酸盐缓冲液（pH7.2)
Tween-20
B.3封闭液
抗原包被液
999. 5 m1.
0, 5 mL
称取0.5 g明胶,加入5ⅡL抗原包被羧，加热落解，然后再加入 95 mL抗原包被掖，冷却至案温备用。
B,4 血清稀释液
洗涤液
100 mL
称取0.5g明胶，加入5mL洗涤液，加热溶解，然后再加人95mL洗涤液，冷却至室温备用。底物溶液
B. 5. 1柠檬酸盐缓冲液(0. 1 mol/1,pH4. 0)柠檬酸
氢氧化钠
蒸馏水
用 1 mol/L 的盐酸调 pH 值至 4. 0,加蒸馏水至 500 mI.,1 C保存备用。4
anurafoc
B.5.2底物储存液
蒸馏求
分装，一20℃保存备匝。
B. 5. 3过氧化氢(H20,)稀释液(临用前配制）30乐过氧化氢
柠檬酸盐缓冲液
B.5.4底物工作液（临用前配制）柠檬酸盐缓冲液
过氧化氢（H,O,)稀释液
ABTS储存液
725 μL
GB/T 22329—2008
GB/T22329—2008
稀释液
酶标记
二抗对照
标雅翡性
棕雅阳此
（规范性附录）
酶标板使用格式
http://w
rwwfoodmate.net
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