本标准规定了双歧杆菌的检验方法。本标准适用于食品中双歧杆菌的检验。

ICS_07.100.30
中华人民共和国国家标准
GB/T4789.34—2003
食品卫生微生物学检验
双歧杆菌检验
Microbiological examination of food hygiene-Examination of Bifidobacterium2003-08-11发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-01-01实施
GB/T4789.34—2003
本标准的附录A、附录B是规范性附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、北京市卫生防疫站本标准主要起草人：杨宝兰、冉陆、李志刚、王淑真、杨大进、贾珍珍。264
1范围
食品卫生微生物学检验
双歧杆菌检验
本标准规定了双歧杆菌的检验方法。本标准适用于食品中双歧杆菌的检验。2规范性引用文件
GB/T4789.342003
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T4789.28--2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
双歧杆菌Bifidobacterium
一群能分解葡萄糖，产生大量乙酸和乳酸，厌氧，不耐酸，不形成芽胞，不运动，细胞呈现多样形态的革兰氏阳性杆菌。
双歧杆菌菌落计数
enumeration of Bifidobacterium在一定条件培养后，所得1mL(g)检样中所含双歧杆菌菌落数。4设备和材料
4.1恒温培养箱：36℃土1℃。
4.2恒温水浴锅：46℃士1℃。
4.3显微镜：10×~100×。
厌氧培养装置：厌氧罐、厌氧箱。4.4
4.5离心机：3000z/min。
4.6气相色谱仪：（具有氢火焰检测器FID)。架盘药物天平：0g~500g，精度0.5g。4.7
灭菌吸管：1mL（具0.01刻度）、10mL（具0.1刻度）。4.8
灭菌平血：直径90mm。
广口瓶或锥形瓶：300mL，500mL。4.10
5培养基和试剂
5.10.85%灭菌生理盐水。
5.2TPY琼脂培养基：见第A.3章。5.3BL琼脂培养基：见第A.2章。265
GB/T4789.34—2003
5.4BBL琼脂培养基：见第A,1章。5.5双歧杆菌生化用基础培养基：见第A.4章。5.6PYG液体培养基：见第A.5章。革兰氏染色液：按GB/T4789.28—2003中2.2规定。5.7
5.8灭菌液体石蜡。
5.9甲醇：分析纯。
三氯甲烷：分析纯。
硫酸：分析纯。
冰乙酸：分析纯。
5.13乳酸：分析纯。
5.14乙酸标准溶液：吸取分析纯冰乙酸5.7mL，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B，此溶液浓度约为1mol/L。5.15乙酸标准使用液：将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。5.16乳酸标准溶液：吸取分析纯乳酸8.4mL，移人100mL容量瓶中，加水至刻度，标定，标定方法见附录B,此溶液浓度约为1mol/L。5.17乳酸标准使用液：将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。6检验程序
检验程序见图1。
25mL（g）样品
加225mL灭菌生理盐水，做成几个适当倍数的骼释液选择2个～3个适宜的稀释度，各取0.1mL分别涂布于BL、BBL、TPY培养基36℃±1℃
接种PYG厌氧培养
37℃72h
测定乙酸、乳酸
7操作步骤
庆氧培养
生化培养观察10天
菌种鉴定报告
72h±3h
革兰氏染色，过氧化氢酶试验
菌落计数报告
7.1以无菌操作将充分混匀的检样25g（mL）放人含有225mL灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内作成266
1：10的均匀稀释液。
GB/T4789.34—2003
7.2用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注人含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液。7.3另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。
7.4选择2个～3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，各取0.1mL分别加人计数培养基平血，均匀涂布，每个稀释度作两个平皿。最好同时选用2种～3种培养基（BL、BBL、TPY培养基），同时作灭菌生理盐水空白对照。7.5待琼脂表面干后，翻转平血，放至厌氧罐内，操作全过程须在20min内完成。7.6将厌养罐置36℃土1℃温箱内培养72h士3h，观察双歧杆菌菌落特征见表1。选取菌落数在30～300之间的平板对可疑菌落进行计数，随机挑取五个可疑菌落进行革兰氏染色、显微镜检查和过氧化氢酶试验。过氧化氢酶阴性，革兰氏染色阳性、无芽胞、着色不均匀、出现“Y”或“V”型的分叉状、或棒状等多形态的杆菌可定为双歧杆菌。表1双歧杆菌在不同培养基上菌落生长形态特征培养基
BL培养基为黄色
BBL培养基为黄色
TPY培养基为黄色
双歧杆茵特征
菌落中等大小，表面光亮，边缘整齐呈瓷白色、奶油色，质地柔软、细腻菌落中等大小，表面光滑、凸起，边缘整齐呈奶油色，质地柔软、细腻菌落表面光滑，凸起，边缘整齐呈奶油色、瓷白色，质地柔软、细腻7.7菌落计数：根据证实为双歧杆菌的菌落数，计算出平皿内的双歧杆菌数，然后乘以样品的稀释倍数，得每毫升样品中双歧杆菌数。取三种培养基中计数最高的为最终结果，例如，检样1X10*倍的稀释液在BBL琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为双歧杆菌的是4个，则1mL样品中双歧杆菌数为：
10×35×4/5×10*=2.8×106
8双歧杆菌菌种监定
8.1生化试验
8.1.1菌种制备：自平板上挑取菌落，接种于BL、BBL或TPY琼脂平板上，放至厌氧罐内，于36℃土1℃、72h士3h厌氧培养。刮取菌苔，制备菌悬液，浓度为10°cfu/mL～10lcfu/mL，分别进行试验。8.1.2生化鉴定试验：双歧杆菌一般不还原硝酸盐（但当培养基有溶解的红细胞时，可以还原硝酸盐），不产靛基质和硫化氢。常用双歧杆菌的碳水化合物反应见表2。表2双歧杆菌属内种的鉴别要点
常用双歧杆菌
1.分叉双歧杆菌
(B.bifidum)
2.长双歧杆菌
(B.longum)
3.婴儿双歧杆菌
(B.infantis)
4.短双歧杆菌
(B.breve)
5.青春双歧杆菌
(B,adolescentis)
L-阿拉伯糖
D-核糖
注：d表示有些菌株阳性，有些菌株阴性。乳糖
【山梨醇
纤维二糖
松三糖
棉子糖
葡萄糖酸盐
GB/T4789.34——2003
8.2气相色谱法分析双歧杆菌的有机酸代谢产物自平板上挑取菌落，接种于PYG液体培养基，厌氧36℃士1℃、72h士3h培养，取除菌上清液分析双歧杆菌的有机酸代谢产物。双歧杆菌分解葡萄糖，生成乙酸和乳酸，形成比约3：2。样品经酸化、离心后，上清液直接进气相色谱仪测定其中的乙酸。样品经硫酸甲醇甲酯化，以三氯甲烷提取，取三氟甲烷层进气相色谱仪测定其中的乳酸。8.2.1分析步骤
8.2.1.1样品处理
8.2.1.1.1乙酸测定：取除菌上清液2mL~3mL，加人体积分数为50%硫酸0.1mL，混匀4000/min离心5min，吸取上清液分析。
8.2.1.1.2乳酸测定：取除菌上清液2mL~3mL，放人10mL比色管中，100℃水浴10min，加人体积分数为50%硫酸0.2mL，甲醇1mL，58℃水浴30min后加水1mL，加三氯甲烷0.5mL，振摇3min，3000r/min离心5min，取三氯甲烷层分析。8.2.1.2测定
8.2.1.2.1气相色谱仪参考条件
8.2.1.2.1.1色谱柱：内径3.2mm，长2m的不锈钢柱，内装涂以30g/L磷酸的60目80目GDX401。
8.2.1.2.1.2氢火焰检测器（FID）：气化室、检测器温度：200℃；氮气流速：60mL/min，氢气流速：55mL/min空气流速：600mL/min，纸速：0.5mm/min。8.2.1.2.3根据保留时间定性，外标法定量。计算见式（1)：A
式中：
X——样品中有机酸的含量，单位为微摩尔每毫升（μmol/mL）；A-—被测定样液中有机酸的含量，单位为微摩尔(μmol)；V—一样品体积，单位为毫升(mL)。结果的表述报告平行测定的算术平均值的两位有效数。8.2.1.2.4色谱图见图2。
8.2.1.2.5允许差：相对相差≤15%。8.2.2最低检出浓度
-乙酸为0.6μmol/mL；
乳酸为0.8μmol/mL。
（1）
A.1BBL琼脂培养基
A.1.1成分
蛋白陈
酵母粉
葡萄糖
可溶性淀粉
氯化钠
5%半胱氨酸
西红柿浸出液
吐温-80.
肝提取液
蒸馏水
pH7.0±0.1
A.1.2制法
附录A
（规范性附录）
专用培养基及试剂
GB/T4789.34-2003
A.1.2.1西红柿浸出液的制备：将新鲜西红柿洗净称重后切碎，加等量蒸馏水在100C水浴中加热，时时搅拌，约90min，然后用绒布过滤，校正pH7.0，分装锥形瓶，115℃高压灭菌15min20min。A.1.2.2肝提取液的制备：称取新鲜猪肝1000g，切成小块或绞碎，加蒸馏水至2000mL，混匀，置冰箱中过夜。第二天煮沸15min～20min，绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。分装锥形瓶。A.1.2.3按A.1.1成分配制，校正pH7.0，分装锥形瓶，115℃高压灭菌15min~20min。A.2BL琼脂培养基
A.2.1成分
蛋白陈
植物陈
酵母粉
葡葡糖
可溶性淀粉
牛肉膏
吐温-80
肝提取液
5%半胱氨酸
GB/T4789.34—2003
蒸馏水
PH7.2±0.1
A.2.2制法
A.2.2.1A液的制备：称取磷酸二氢钾10g，磷酸氢二钾10g，加蒸馏水至100mL，混匀，115℃高压灭菌15min~20min。
A.2.2.2B液的制备：称取硫酸镁10g，硫酸亚铁0.5g，氯化钠0.5g，硫酸锰0.337g，加蒸馏水至250mL，混匀，115℃高压灭菌15min～20min。A.2.2.3按A,2.1成分配制，校正pH7.2，分装锥形瓶，115℃高压灭菌15min～20min。A.3TPY琼脂培养基
A.3.1成分
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植物陈
酵母粉
葡萄糖
5%半胱氨酸
磷酸氢二钾（K,HPO,）
氯化镁（MgCl。·6H，O)
硫酸锌（ZnSO,·7HO)
氯化钙（CaCl,）
氯化铁（FeCl）
吐温-80
蒸馅水
pH6.5±0.1
A.3.2制法
将A.3.1成分加热溶解、校正至pH6.5士0.1,分装锥形瓶，115℃高压灭菌15min～20min。A.4双歧杆菌生化用基础培养基
A.4.1成分
蛋白陈
吐温-80
溶液B
L-半胱氨酸
1.6%溴甲酚紫
pH7.2±0.1
A.4.1.1B液：称取硫酸镁10g，硫酸亚铁0.05g，氯化钠0.5g，硫酸锰0.337g，加蒸馏水至250mL。A.4.1.2用于糖分解试验的培养基配制：将基础培养基成分（除指示剂溶液外）溶解后，调pH至7.2士0.1，再加指示剂溶液。糖的种类按0.5%加入（七叶苷为0.25%），分装小试管，每管3mL，115℃高压灭菌20min。
生化试验必须设无糖对照管，每管接种菌悬液0.05mL，直接接种到培养基的底部。因双歧杆菌是270
GB/T4789.34—2003
专性厌氧，所以要在培养基上面盖上一层液体石蜡（0.8mL）。37℃培养7d～10d。A.4.2观察结果
第4天和第10天两次观察糖分解性能。以培养基中的指示剂变色情况判定：微黄色为士，部分变黄者为十，全部变黄者微透明为十，全部变黄且菌发育明显呈混浊者为十十。A.5PYG液体培养基
A.5.1成分
蛋白陈
葡萄糖
酵母膏
盐酸半胱氨酸
盐溶液
维生素Ki溶液
氯化血红素溶液5mg/mL
蒸馏水
pH7.2±o.1
A.5.1.1盐溶液的配制：称取无水氯化钙0.2g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾1g，磷酸二氢钾1g，碳酸氢钠10g，氯化钠2g，加蒸馏水至1000mL。A.5.1.2氯化血红素溶液（5mg/mL）的配制：称取氯化血红素0.5g溶于1mol/L氢氧化钠1mL中，加蒸馏水至100mL，121℃高压灭菌15min，冰箱保存。A.5.1.3维生素K，溶液的配制：称取维生素K，1g加无水乙醇99mL，过滤除菌，放冷暗处保存。A.5.1.4制法：将A.5.1戒分混合加热溶解，冷后调pH至7.2.加热10min，过滤，121℃高压灭菌15min。
GB/T4789.34—2003
附录B
（规范性附录）
标准溶液的标定
乙酸的标定：准确称取乙酸3g，加水15mL，酚酞指示液两滴，用1mol/L氢氧化钠溶液滴定，并B.1
将滴定结果用空白试验校正。1mL1mol/L氢氧化钠溶液相当于60.05mg的乙酸（C，H,O，）。B.2乳酸的标定：准确称取乳酸1g，加水50mL，精密加人氢氧化钠滴定液（1mol/L）25mL，煮沸5min，加人酚指示液两滴，趁热用0.5mol/L硫酸滴定液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。每1mL1mol/L氢氧化钠滴定液相当于90.08mg的乳酸（CgHgO,)。272
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